高效抑制大腸埃希氏菌的芽孢桿菌的 發酵培養基及發酵條件優化

張子豪,康建依,謝遠紅,易欣欣,劉 慧,侯 爽,馬 祎,高秀芝

(北京農學院食品科學與工程學院,食品質量與安全北京實驗室,農產品有害微生物 及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室,微生態制劑關鍵技術開發北京市工程實驗室,北京 102206)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)是人和動物腸道的正常寄居菌,但大腸埃希氏菌極易造成食品的污染[1-3],從而能夠引起人和動物的疾病,同時,由大腸桿菌 O157感染致病的病例于1982年在美國首次出現[4],隨后于世界各國迅速傳播與擴散,是危害嚴重的腸胃疾病之一,近年來,集約化養殖場其他主要疾病已得到基本控制,但大腸桿菌病有明顯的上升趨勢,已成為養禽業主要的細菌疾病之一[5]。我國各個省份肉制品中檢查出相關大腸桿菌的現象時有發生[6],如史秋梅等[7],檢測了河北省內不同地區的生活用肉、蛋類等105個樣品,檢測到大腸桿菌19株,大腸桿菌陽性檢出率為18.1%。陳玲等[8]檢測200份江蘇地區食品樣品,大腸桿菌0157的分離率1.5%。

目前由于抗生素廣泛使用,大腸桿菌對各種抗生素耐藥性已經到了很嚴重的地步[9-10],故需求一種安全可靠、能夠代替抗生素的無殘留的替代品。研究發現芽孢桿菌能產生多種抗菌代謝產物,被認為能有效防治植物病害,抑制多種病原性微生物[11-14],芽孢桿菌發酵簡便,抑菌蛋白性質穩定,水溶性較好,適合應用于微生物制劑[15]。近年來學者在解淀粉芽孢桿菌的新發現與發酵條件的優化方面進行了大量探索[16-18],致力于將其代謝產物應用于果蔬與冷卻肉的保鮮研究中[19-21],如:孔維佳等[22]研究發現一株解淀粉芽孢桿菌代謝產物對擴展青霉有強拮抗作用,可用于果蔬采后青霉病的抑制劑。時威等[23]研究發現，解淀粉芽孢桿菌發酵液處理組可將冷卻肉的保質期延長6～9 d,而且效果優于Nisin。

本試驗以大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)為指示菌,從校園土壤中篩選出具有抑菌效果的芽孢桿菌,對其進行菌種鑒定,采用單因素與正交試驗,對發酵培養基及發酵條件進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)ATCC 11775 中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏菌株;菌株G3E 分離自北京農學院校園土壤;營養肉湯(nutrient broth,NB)培養基、營養瓊脂(nutrient agar,NA)培養基 北京陸橋;功能菌發酵培養基:淀粉10 g/L、氯化鈣4 g/L、酵母浸出物4 g/L、胰蛋白胨4 g/L、尿素2 g/L;氯化鈉 分析純,北京化工廠;葡萄糖 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;麥芽糖、可溶性淀粉(以下簡稱淀粉) 分析純,奧博星生物技術公司;尿素 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;胰蛋白胨、酵母浸出物 生物試劑,奧博星生物技術公司;硫酸鎂 分析純，西隴化工廠;氯化鈣 分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

PHS-3B型酸度計 上海雷磁儀器廠;TG16-WS高速臺式離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;牛津杯(內徑(6±0.1) mm,外徑(7.8±0.1) mm) 北京先驅威鋒技術開發公司;0.25 μm無菌濾器 德國Merck MiLLipore集團;DHZ-C1全溫振蕩器 太倉市試驗設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 大腸埃希氏菌指示平板的制備 用接種環挑取大腸埃希氏菌一環，接種于50 mL營養肉湯中,37 ℃、150 r/min搖床培養18～24 h,取1 mL菌液梯度稀釋于9 mL生理鹽水中,測定其菌落總數,使菌液濃度為108CFU/mL。取0.2 mL菌液于200 mL冷卻未凝固的營養瓊脂中混勻,倒平板待用。

1.2.6.4 功能菌發酵培養基正交優化實驗 以淀粉添加量、酵母浸出物∶胰蛋白胨∶尿素添加量(2∶2∶1)及氯化鈣添加量為因子,抑菌圈直徑為指標,進行L16(43)正交實驗,因素水平表見表1。

1.2.2.3 復篩及菌種鑒定 以得到的對大腸埃希氏菌有明顯抑制作用的菌株G3E為功能菌株,進行功能菌發酵粗提液制備及抑菌效果測定實驗,進一步確認其抑菌活性,并送中國科學院微生物研究所進行菌種鑒定。

選擇我院中2016年2月至2016年9月中收治得得手術患者100例作為研究對象,按照患者的入院順序將其分為對照組和實驗組,兩組中均包含50例患者。對照組中包括男性患者21例,女性患者29例,患者年齡為45—68歲,平均年齡為(57.4±3.9)歲;實驗組中包括男性患者26例,女性患者24例,患者年齡為41—65歲,平均年齡為(54.7±4.9)歲。兩組患者均進行常規手術,術后進行護理,無相關手術禁忌癥和其他器質性疾病。兩組患者在一般資料上無統計學意義,具有可比性。

1.2.2.2 對大腸埃希氏菌具有抑菌活性的芽孢桿菌的初篩 以接種環點接種各株芽孢桿菌至大腸埃希氏指示平板表面,37 ℃培養24 h,記錄并保存活性菌株。

1.2.2.1 芽孢桿菌初篩 取校園不同區域土樣5份,稱取各土壤樣品10 g于90 mL無菌生理鹽水,200 r/min振蕩5 min,80 ℃水浴30 min[24],制成1∶10的土壤稀釋液,取1 mL涂布于NA平板,37 ℃培養24～48 h,選取具有單菌落的平板,挑取單菌落2次劃線并編號，接種至NA平板繼續培養24 h,將鏡檢后產芽孢的菌株保藏備用[25]。實驗室菌庫芽孢桿菌15株(來源于發酵豆醬)活化備用。

2）部分品種抗倒性不強。小麥品種之間抗倒性差異明顯，種植了抗倒性差的品種，會加大倒伏發生的風險［7］。

1.2.2 抑制大腸埃希氏菌的芽孢桿菌篩選

1.2.3 功能菌發酵粗提液制備實驗 將篩選所得菌體G3E以接種環劃線至營養瓊脂平板培養12 h,于此平板中取一環接入50 mL營養肉湯中,35 ℃,150 r/min培養12 h作為種子液,以2%的接種量將種子液接入50 mL營養肉湯中,35 ℃,150 r/min培養24 h[26],4 ℃、4000 r/min離心20 min,取上清液過0.22 μm濾膜,備用。

期刊評級主要是通過引文數據庫，期刊前幾年發表的文獻在統計當年被引用次數除以該刊前幾年發表的文獻數（有些會包含新聞等，有些不含）。

“君子懷德”，儒家傳統文化以“君子”命名具備高尚道德節操的賢哲志士：“所謂君子者，躬行忠信，其心不買； 仁義在己，而不害不志； 聞志廣博，而色不伐； 思慮明達，而辭不爭； 君子猶然如將可及也，而不可及也。 如此，可謂君子矣。”(《大戴禮記·哀公問五義》)儒家君子理想境界所展現的精神實質，強調具有自強不息的獨立人格品質，奮發坦蕩的無畏開拓意志，以及為國家、民族與理想忠誠奮斗的奉獻精神。 在儒家文化浸染下，朱熹在《王梅溪文集序》對君子人格形象進行了論述：

1.2.6 功能菌發酵培養基的優化

1.2.5 功能菌發酵實驗最佳接種量試驗 將功能菌分別以1%、2%、5%和8%[35]的接種量進行功能菌發酵粗提液制備實驗,并設置三組平行實驗,以所得功能菌發酵粗提液進行抑菌效果測定實驗。

1.2.4 抑菌效果測定實驗 將牛津杯放置于大腸埃希氏菌指示平板表面,向其中加入0.2 mL功能菌發酵粗提液,37 ℃培養24 h,測量其抑菌圈直徑。

1.2.6.1 碳源單因素實驗 固定功能菌發酵培養基氮源為酵母浸出物10 g/L,無機鹽為氯化鈣4 g/L,分別考察以蔗糖、葡萄糖、麥芽糖及淀粉各10 g/L為碳源時抑菌圈直徑的大小。

1.2.6.2 氮源單因素實驗 固定功能菌發酵培養基碳源為淀粉10 g/L,無機鹽為氯化鈣4 g/L,考察分別以酵母浸出物、牛肉膏、酵母浸出物∶胰蛋白胨(1∶1)、酵母浸出物∶胰蛋白胨∶尿素(2∶2∶1)、酵母浸出物∶胰蛋白胨∶氯化銨(2∶2∶1)、尿素及氯化銨各10 g/L為氮源時抑菌圈直徑的大小。

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1.2.6.3 無機鹽單因素實驗 固定功能菌發酵培養基碳源為淀粉10 g/L,氮源為酵母浸出物∶胰蛋白胨∶尿素(2∶2∶1)10 g/L,考察分別以硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鈉、氯化鈣及硫酸錳各4 g/L為無機鹽時抑菌圈直徑的大小[27]。

“我希望我能為我的國家基礎建設奉獻力量，雖然我只是大專學歷，但是努力過后誰又知道我能走到哪一步呢？”也許，信念才是最好的動力，從風雨里來，在霜雪中走，經過不斷的磨煉與實踐，從部員到工程部的領頭人，再到現在的項目總工程師，一步一個腳印，踏踏實實，讓每個人都看到了這個帥氣的河北漢子的堅毅與剛強。

在城市中進行市政工程建設的核心目的就是提高人們的生活質量，提高城市中的生產效率，因此，要加強對市政工程建設的重視。市政工程有許多部分共同工程，給排水工程是其中最為重要的一部分，工程建設期間，施工操作與城市的正常運行會產生直接聯系，由此可見，高質量的市政工程，對于提高城市中生活人們質量，以及維護社會穩定性來說都有著重要作用，同時，也可以確保社會的健康發展。

表1 發酵培養基正交試驗因素水平表Table 1 Factors levels of fermentation medium orthogonal experiment

1.2.7 功能菌發酵條件的優化 以培養溫度、培養時間及培養基pH為因子,結合解淀粉芽孢桿菌培養條件相關研究[28-31],選取正交因子水平范圍,以抑菌圈直徑為指標,進行L16(43)正交實驗,因素水平表見表2。

3)直流側單極故障時高接地阻值有利于故障穿越及系統恢復，直流電壓不平衡保護作為該類故障的主保護并動作于報警，系統可帶故障運行；由故障選線定位策略實現該故障類型的隔離。

表2 發酵條件正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of culture condition orthogonal experiment

1.3 數據處理

利用Excel 2007和SPSS 18分析軟件對數據進行統計分析,并結合Duncan氏法做多重比較,所有實驗均重復三次,結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 功能菌篩選與鑒定

經過初篩、復篩及大腸埃希氏菌抑菌效果驗證試驗,得到2株對大腸埃希氏菌有明顯抑制作用的菌體,選取抑菌效果最好的芽孢桿菌G3E作為功能菌株,其在大腸埃希氏菌指示平板上抑菌圈可達到15.0 mm。根據菌種的細胞形態、生理生化特征、16S rRNA基因序列、gyrB基因序列等實驗數據綜合分析,經鑒定G3E菌種為解淀粉芽孢桿菌植物亞種Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarum(同種異名:貝萊斯芽孢桿菌Bacillusvelezensis),NCBI登錄號為:KY621478.1。

2.2 不同接種量對解淀粉芽孢桿菌G3E抑菌效果的影響

不同接種量對解淀粉芽孢桿菌G3E抑菌效果的影響結果如圖1所示,當接種量為2%時,發酵上清液的抑菌活性最高,抑菌圈直徑達到(17.2±0.10) mm,確定2%為最佳接種量。

圖1 接種量對解淀粉芽孢桿菌G3E的抑菌效果的影響Fig.1 Effect of different inoculation amount on Bacillus amyloliquefaciens G3E antibacterial activity注:字母不同表示差異顯著(p<0.05);圖2～圖4同。

2.3 解淀粉芽孢桿菌G3E發酵培養基優化試驗

2.3.1 不同碳源對解淀粉芽孢桿菌G3E抑菌效果的影響 不同碳源對解淀粉芽孢桿菌G3E活性影響如圖2所示,麥芽糖與其它碳源有顯著性差異(p<0.05),其它三種碳源對抑菌活性物質表達的影響差異不顯著。碳源為淀粉時,發酵上清液抑菌活性最大,其抑菌圈直徑達到(16.7±0.30) mm。結合趙延存等[32]的研究結果,選擇淀粉為解淀粉芽孢桿菌G3E發酵培養基的最佳碳源。

圖2 碳源種類對解淀粉芽孢桿菌G3E抑菌活性的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on Bacillus amyloliquefaciens G3E antibacterial activity

2.3.2 不同氮源對解淀粉芽孢桿菌G3E抑菌效果的影響 不同氮源對解淀粉芽孢桿菌G3E抑菌活性的影響如圖3所示,氮源的改變對抑菌活性影響顯著(p<0.05),當氮源為6號與7號時,抑菌活性消失,3號與其它氮源有顯著性差異(p<0.05),發酵上清液抑菌活性較低。以4號氮源進行發酵培養時,發酵上清液抑菌活性最大,優于其它6種氮源,其抑菌圈直徑達到(18±0.10) mm,故選擇4號,即酵母浸出物∶胰蛋白胨∶尿素(2∶2∶1)為解淀粉芽孢桿菌G3E發酵培養基的最佳氮源。

圖3 氮源種類對解淀粉芽孢桿菌G3E抑菌活性的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on Bacillus amyloliquefaciens G3E antibacterial activity

2.3.3 不同無機鹽對解淀粉芽孢桿菌G3E抑菌效果的影響 不同無機鹽對解淀粉芽孢桿菌抑菌活性的影響如圖4所示,無機鹽的改變對抑菌活性影響顯著(p<0.05),當無機鹽為硫酸錳時,抑菌活性消失。其它四種無機鹽相互之間差異顯著(p<0.05),當無機鹽為氯化鈣時,發酵上清液抑菌活性最大,其抑菌圈直徑達到(20±0.10) mm,故選擇氯化鈣作為解淀粉芽孢桿菌G3E發酵培養基無機鹽。有研究表明,鈣離子可提高細菌發酵產物產量,提高其催化及代謝功能,增強抑菌活性,與本文結果一致[33]。

圖4 無機鹽種類對解淀粉芽孢桿菌G3E抑菌活性的影響Fig.4 Effects of different inorganic salts on Bacillus amyloliquefaciens G3E antibacterial activity

2.3.4 發酵培養基正交優化實驗 解淀粉芽孢桿菌G3E發酵培養基正交優化試驗結果如表3所示,從抑菌圈直徑指標來看,影響抑菌活性的影響因素順序為:碳源>氮源>無機鹽,抑菌能力表達最佳發酵培養基為A2B2C2,即碳源10 g/L、氮源10 g/L、無機鹽4 g/L。

表3 發酵培養基 L16(43)正交試驗設計及結果Table 3 L16(43)orthogonal array design and results of fermentation medium

優化解淀粉芽孢桿菌發酵培養基可有效提高抑菌活性物質的產量及防效[34]。以淀粉10 g/L、氯化鈣4 g/L、酵母浸出物4 g/L、胰蛋白胨4 g/L、尿素2 g/L為發酵培養基，進行抑菌效果驗證試驗,所得抑菌圈平均直徑為(22.5±0.50) mm,此時解淀粉芽孢桿菌G3E抑菌物質表達能力優于培養基正交試驗中各試驗組。

2.4 解淀粉芽孢桿菌G3E發酵條件正交試驗

解淀粉芽孢桿菌G3E抑菌物質發酵條件正交優化試驗結果如表4所示,從抑菌圈直徑指標來看,影響抑菌活性的影響因素順序為:培養溫度>培養時間>pH,抑菌能力表達最優發酵條件為A4B4C1,即40 ℃、40 h、pH7.0,恰為正交試驗第16組,此時解淀粉芽孢桿菌G3E發酵上清液抑菌圈直徑為可達(23.6±0.4) mm。顯著大于以普通細菌發酵條件(35 ℃、24 h、pH7.0[35])的(15.0±0.3) mm(p<0.05)。

表4 發酵條件L16(43)正交試驗設計及結果Table 4 L16(43)orthogonal array design and results of fermentation conditions

3 結論

本研究從土壤中篩選對大腸埃希氏菌具有高抑菌活性的芽孢桿菌,采用單因素與正交試驗,對發酵培養基及發酵條件進行優化,解淀粉芽孢桿菌植物亞種G3E發酵培養基正交實驗表明,影響抑菌活性的因素順序為:碳源>氮源>無機鹽,最佳發酵培養基為淀粉10 g/L、氯化鈣4 g/L、酵母浸出物4 g/L、胰蛋白胨4 g/L、尿素2 g/L。

解淀粉芽孢桿菌植物亞種G3E發酵條件正交實驗表明,影響抑菌活性的因素順序為:培養溫度>培養時間>pH,最佳發酵條件為40 ℃、40 h、pH7.0,以2%接種量進行菌體發酵,發酵液上清的抑菌圈直徑可以達到(25.5±0.5) mm。