基于MiSeq高通量測序技術 內蒙古地區酸粥細菌多樣性研究

王玉榮,折米娜,劉康玲,張振東,雙 全,*

(1.內蒙古農業大學食品科學與工程學院,內蒙古呼和浩特 010018) 2.湖北文理學院食品科學技術學院,鄂西北傳統發酵食品研究所,湖北襄陽 441053)

作為一種傳統地方發酵食品,酸粥在我國已有上千年的制作和食用歷史,因其風味獨特、酸滑適口、營養豐富,而深受內蒙古中西部、陜西北部和山西西北部等地人們的青睞[1-2]。酸粥主要以糜米和大米等谷物為原料,經自然發酵制作而成,這種傳統的制作方法較好地保存了當地環境中的微生物[3]。近年來,研究人員采用傳統微生物學手段,對酸粥微生物多樣性進行了卓有成效的研究。白梅等[4]采用傳統微生物學手段,從內蒙古西部地區28份酸粥樣品中分離出40株酵母菌;王煒宏等[5]對從內蒙古鄂爾多斯地區采集的酸粥樣品分離的乳酸菌進行了分離鑒定,認為該地區酸粥發酵液中的優勢菌群為干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei);李文亞等[6]通過個體形態特征觀察和生理生化試驗等方法,對晉西北酸粥中酵母菌進行了分離鑒定,得出釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)和庫德畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)存在于整個酸粥發酵過程中。上述研究的開展,為明確酸粥中微生物的多樣性提供了借鑒,然而這些研究多數是以微生物純培養技術為主要研究手段,因而在研究酸粥中微生物群體的物種組成方面顯示出一定的片面性和局限性,因而采用分子生物學手段,對內蒙地區酸粥中細菌多樣性進行解析是必要的[7]。

Illumina MiSeq高通量測序技術因具備靈敏度高、讀數長和效率高的特點,比傳統微生物學手段能更加真實的反映發酵食品中微生物群落結構信息[8]。近年來,該技術已廣泛應用于植物內生真菌多樣性分析[9]、環境微生物群落結構監測[10]以及發酵食品中微生物多樣性研究[11-12]等領域。

本文以內蒙古地區酸粥為研究對象,采用高通量測序技術與傳統微生物學方法相結合的手段,對酸粥樣品中細菌進行分離鑒定和多樣性研究,同時使用多元統計學手段對其群落結構信息進行解析,以期為傳統發酵食品中菌種發掘提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸粥 采集自內蒙古烏拉特前旗、杭錦后旗和準格爾旗各農戶家中,編號分別為A1、A2和A3,樣品采集后置于含有干冰的采樣箱中,運回實驗室分裝備用;MRS培養基 青島海博生物技術有限公司;碳酸鈣、過氧化氫、三氯甲烷、氯化鈉、氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷 國藥集團化學試劑有限公司;Axygen清潔試劑盒 康寧生命科學(吳江)有限公司;QIAGEN DNeasymericon Food Kit試劑盒 德國QIAGEN公司;FastPfu Buffer、dNTPs Mix、FastPfu Fly DNA Polymerase、5×TransStartTM、蛋白酶K 寶生物工程(大連)有限公司;6×Loading buffer、DL500 DNA Marker 寶日醫生物技術(北京)有限公司;引物338F/806R(正向引物中加入7個核苷酸barcodes)、27F/1495R 均由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。

5810R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;DYY-12電泳儀 北京市六一儀器廠;ND-2000C微量紫外分光光度計 美國Nano Drop公司;UVPCDS8000凝膠成像分析系統 美國BIO-RAD公司;Veriti梯度基因擴增儀 美國AB公司;Miseq PE300高通量測序平臺 美國Illumina公司;R920機架式服務器 美國DELL公司;SX-700高壓滅菌鍋 寶生物工程(大連)有限公司;DG250厭氧工作站 英國DWS公司;ECLIPSE Ci生物顯微鏡 日本Nikon公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品宏基因組提取 參照QIAGEN DNeasymericon Food Kit試劑盒中的使用方法,提取酸粥樣品總DNA。

1.2.2 細菌16S rRNA PCR擴增及檢測 擴增體系為4 μL 5×PCR Buffer,2 μL 2.5 mmol/L dNTPs mix,5 μmol/L 338F和806R各0.8 μL,0.4 μL 5 U/μL Taq酶,模板10 ng,用無菌ddH2O補齊至20 μL。PCR擴增程序為:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性1 min,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸90 s,將變性、退化和延伸三步循環次數設定為30,然后72 ℃完全延伸10 min,維持4 ℃[13-14]。擴增產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳(120 V,30 min)檢測是否擴增出目的條帶。

1.2.3 擴增產物純化及定量 用清潔試劑盒清潔PCR產物,微量紫外分光光度計檢測OD260/OD280在1.8～2.0之間的產物,用無菌ddH2O將濃度稀釋至100 nmol/L后寄至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行Miseq高通量測序。

1.2.4 雙端序列拼接及質量控制 將雙端序列拼接成一條序列,拼接過程中將同時滿足以下條件的序列予以保留:重疊區域堿基數≥10 bp,最大錯配率≤0.2,引物或便簽的錯配堿基數≤2 bp和切掉的堿基數≥50 bp[15]。

1.2.5 生物信息學分析 參照郭壯等[16]、Edgar[17]和Caporaso等[18]的方法,利用QIIME分析平臺分析質控后的高質量序列:首先進行100%序列鑒定聚類分析,再根據97%相似性對這些序列進行操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)劃分;從每個OTU中選擇一條代表性序列,利用RDP軟件[19]和Greenbank數據庫對其進行同源性比對分析,分別在門、綱、目、科和屬水平對各樣品的細菌多樣性進行統計。

1.2.6 核酸登錄號 本研究中所有序列數據已提交至MG-RAST數據庫,ID號為mgp83829。

1.2.7 乳酸菌的分離鑒定 將樣品搖勻后用移液槍吸取0.5 mL進行倍比稀釋,取10-3、10-4和10-53個稀釋度,分別涂布到含1.0%～1.2% CaCO3的MRS瓊脂培養基上,37 ℃厭氧培養48 h后進行菌株純化、生理生化鑒定及保藏。采用CTAB法[20]對純化菌株進行DNA提取,然后進行PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳檢測、擴增產物清潔、連接pMD18-T載體并用連接產物轉化大腸桿菌Top10,挑取陽性克隆送至金斯瑞生物科技有限公司測序。在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上對測序結果進行同源性比對,并與從LPSN(http://www.bacterio.net/)上下載的標準菌株一起構建系統發育樹。

1.3 數據分析

使用維恩(Venn)圖展示不同樣品中共有或特有的OTU數,使用皮爾森(Person)相關性分析法分析各核心OTU之間的相關性。Venn圖由Venny 2.1.0(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線繪制,熱圖由Matlab 2010b軟件繪制,系統發育樹由BioEdit 7.1.3、DNAMAN8和Mega 5.05繪制,其他圖使用Origin 8.5軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 序列豐富度和多樣性分析

本研究采集的3個酸粥樣品通過MiSeq高通量測序,共產生84985條序列,經過100%序列鑒定聚類分析后,有25323條代表性序列被發現,再根據97%相似性對這些序列進行分類操作單元劃分后得到334個OTU。酸粥樣品16S rRNA測序結果及各分類水平數量如表1所示。

表1 樣品16S rRNA測序結果及各分類水平數量Table 1 Results of 16S rRNA reads and the number of different classification

作為α多樣性指數,超1指數和香農指數可以從豐度和多樣性兩個維度,對樣品中微生物群落結構進行評價。由表1可知,樣品A3的超1指數最大,而樣品A1的香農指數最大,這說明A3樣品具有最高的細菌物種多樣性,而A1樣品細菌物種豐度最大。本研究進一步采用稀疏性分析和α多樣性指數分析,對取樣深度和物種組成進行了綜合評價[21],在97%相似性水平下,劃分OTU并制作的稀疏性曲線和香農指數曲線如圖1所示。

由圖1可知,盡管依據當前的測序量每個樣品的稀疏曲線依舊不能進入平臺期(A),但是香農指數曲線已經達到飽和狀態(B),這說明,當繼續增加測序量時可能會有少量新的OTU被發現,但樣品微生物多樣性不會再有明顯變化,因而本研究測序深度合適。

2.2 酸粥樣品中細菌構成研究

對測得的序列進行質控后,使用RDP和Greengenes數據庫對合格序列進行同源性比對,比對結果顯示,84985條序列可劃分為7個門、16個綱、22個目和37個屬。酸粥中所有序列在門水平上可鑒定為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、藍細菌門(Cyanobacteria)和異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)。3個酸粥樣品中相對含量大于1.0%的優勢門和屬如圖2所示。

圖2 酸粥中優勢細菌門(A)和屬(B)相對含量Fig.2 Relative content of the dominant bacteria phyla(A) andgenera(B)in acidic-gruelsamples

由圖2(A)可知,其中3個樣品中共有且平均相對含量大于1.0%的細菌門有厚壁菌門(Firmicutes,87.45%)和變形菌門(Proteobacteria,11.84%),二者累積平均相對含量為99.28%。由圖2(B)可知,在屬水平上,3個樣品中共有且平均相對含量大于1.0%的細菌屬有乳酸桿菌屬(Lactobacillus,87.23%)和醋酸桿菌屬(Acetobacter,11.67%),在這一水平上僅有0.64%的序列不能被鑒定出,由此可見,酸粥中細菌主要由乳酸桿菌和醋酸桿菌構成。薛建崗等[22]分析發現了內蒙古西部地區28份酸粥樣品中乳酸菌的平均含量為(7.51±1.23)lg CFU/mL;張春林等[7]采用PCR-DGGE相結合的手段,對內蒙古地區28份自然發酵酸粥樣品進行研究,發現樣品微生物多樣性均較高,且細菌圖譜較真菌圖譜復雜,并得出瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)是酸粥樣品中的最優勢菌的結論,這些研究均與本文結果一致。

進一步對每個樣品中的OTU數進行統計,由圖3可知,3個樣品共測得OTU 334個,僅存在于1個樣品中的OTU有251個,占總OTU數的75.15%,出現2次的OTU有70個,占總OTU數的20.96%,所有樣品中都存在的OTU即核心OTU有13個,占OTU總數的3.89%。基于各樣品中OTU數和序列數繪制的Veen圖如圖4所示。

圖3 OTU出現次數統計Fig.3 Occurrence number of OTU

圖4 基于OTU水平的Veen圖Fig.4 Veen diagram based on OTU level

由圖4可看出,A1、A2和A3中特有的OTU分別為69個、115個和67個,分別占總OTU數的20.66%、34.43%和20.06%,特有的序列條數及占總序列數的比例分別為926(1.09%)、1417(1.67%)和761(0.90%)。A1和A2共有22個OTU,序列16458條;A2和A3共有34個OTU,序列18672條;A1和A3共有14個OTU,序列14423條;13個核心OTU含有32328條序列,占總序列數的比例高達38.04%。以上研究表明,各酸粥樣品中雖含有特有種系但含量較少,多數為共有菌群。進一步對核心OTU相對含量進行了分析,結果如圖5所示。

圖5 核心OTU在各酸粥樣品中的相對含量Fig.5 Relative content of core OTUs in each acidic-gruel sample

由圖5可知,除OTU24、OTU132、OTU108、OTU228和OTU103隸屬于醋酸桿菌屬(Acetobacter)外其余的均屬乳酸桿菌屬(Lactobacillus)。各核心優勢OTU所包含的序列數在各樣品中存在較大差異,尤以OTU171和OTU228。OTU171在A3中的相對含量為13.57%,而在A1中的相對含量僅為2.75%;A2中OTU228的相對含量為11.62%,而A1和A3中,OTU228的相對含量僅為0.15%和0.004%。值得一提的是,OTU119(隸屬于乳酸桿菌屬)和OTU103(隸屬于醋酸桿菌屬)僅在A2中的相對含量大于1.0%。核心OTU相關性熱圖如圖6所示。

圖6 核心OTU相關性熱圖Fig.6 Correlation heat map of the different OTUs注:*表示差異顯著(p<0.05), **表示差異極顯著(p<0.01)。

由圖6可看出,OTU219(屬于Lactobacillus)與OTU25(屬于Lactobacillus)相關性顯著(p<0.05)而與OTU186(屬于Lactobacillus)呈極顯著正相關(p<0.01),OTU25與OTU186呈顯著正相關(p<0.05);OTU119(屬于Lactobacillus)與OTU228(屬于Acetobacter)呈顯著正相關(p<0.05),而與OTU108(屬于Acetobacter)相關性極顯著(p<0.01),OTU141(屬于Lactobacillus)和OTU132(屬于Acetobacter)呈顯著負相關(p<0.05)。根據核心OTU序列進一步構建系統發育樹,結果如圖7所示。

圖7 核心OTU系統發育樹Fig.7 The phylogenetic tree of core OTUs

由圖7可知,13個核心OTU大致可分成乳酸桿菌屬和醋酸桿菌屬兩類,這與核心OTU在各酸粥樣品中的相對含量分析結果一致。分析系統發育樹可發現OTU25與解淀粉乳桿菌(Lactobacillusamylolyticus)較相近,OTU119與鼠李糖乳桿菌(Lactobacillushamster)較相近,OTU265與面包乳桿菌(Lactobacilluspanis)較相近,OTU171與橋乳桿菌(Lactobacilluspontis)較相近,OTU228與過氧化醋酸桿菌(Acetobacterperoxydans)較相近,OTU132與羅旺醋桿菌(Acetobacterlovaniensis)較相近;OTU103與熱帶醋桿菌(Acetobactertropicalis)較相近。

2.3 酸粥中乳酸菌的分離鑒定

從3個酸粥樣品中共分離出9株疑似乳酸菌,生理生化實驗結果顯示,所有菌株過氧化氫酶實驗呈現陰性,而革蘭氏染色為陽性。各菌株鑒定后與標準菌株一起構建系統發育樹如圖8所示。

圖8 乳酸菌系統發育樹Fig.8 The phylogenetic tree of different strains

由圖8可知,A1-2、A1-3、A2-1、A2-2和A2-3屬于發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum),A3-2屬于彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus),A1-1、A3-1和A3-3與植物乳桿菌Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum JCM 1149的系統發育關系最近,故將其鑒定為植物乳桿菌。

3 結論

本文使用第二代高通量測序技術Illumina MiSeq與傳統微生物學方法相結合的手段,對內蒙古地區酸粥樣品中細菌多樣性進行了研究。結果發現,所有細菌可劃分為7個門和37個屬,其中隸屬于厚壁菌門(Firmicutes)的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和醋酸桿菌屬(Acetobacter)為樣品中共有且相對含量大于1.0%的細菌屬,其平均相對含量分別為87.23%和11.67%。同時采用傳統微生物手段,從3個樣品中分離出9株潛在乳酸菌菌株,經鑒定發現有5株為發酵乳桿菌,3株為植物乳桿菌,1株為卷曲乳桿菌。由此可見,該地區酸粥中的細菌主要為乳酸桿菌(Lactobacillus)和醋酸桿菌(Acetobacter)。

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