丁香精油微膠囊工藝優化 及其對冰溫豬肉保鮮效果的影響

孫艷文,邵 京,馬 蕊,何貝貝,李志成

(西北農林科技大學食品科學與工程學院,陜西楊凌 712100)

丁香精油的主要成分為丁香酚、乙酰丁香酚和石竹烯等,具有很好的抗菌、抗氧化和保鮮的功效[1],可減緩食品腐敗,延長保質期[2]。但精油難溶于水,穩定性較差,易揮發和氧化變質,對其品質及市場價值影響很大。采用微膠囊技術可增強被包裹物質的穩定性,降低揮發性,延長保存期[3],還可達到保護、控釋等效果[4],有效克服丁香精油在使用和貯存期間易散失的問題。

目前,制備丁香精油微膠囊的研究大多是以β-環糊精為主要壁材,韓春然等[5]利用超聲乳化方法以β-環糊精為壁材,對丁香精油包埋,通過單因素實驗和響應面試驗,確定了最佳包埋條件:壁芯比6∶1、超聲功率65 W、超聲時間13.4 min;Maestrello等[6]采用噴霧干燥和冷凍干燥技術對丁香精油在β-環糊精中進行包封,發現凍干技術獲得了較高的收率和包封率。β-環糊精雖具有較多優良特性,但不具備抑菌特性。殼聚糖為甲殼素的脫乙酰產物,具有安全、無毒、抑菌、可食及生物降解等多種特性[7]。海藻酸鈉是從褐藻植物中提取得到的高分子多糖,具有安全無毒、生物可降解性、生物相容性等特性[8],海藻酸鈉屬于陰離子聚電解質多糖,其羧基能與二價陽離子交聯從而形成凝膠微球[9]。殼聚糖與海藻酸鈉在靜電作用下可形成聚電解質復合物,有助于提高凝膠微球的載藥率和緩釋性能[10],因此,殼聚糖與海藻酸鈉已成為備受關注的微膠囊制備材料[11]。

冰溫保鮮是指將食品貯藏在0 ℃到初始凍結點的溫度區域帶的一種保鮮方法,與傳統冷藏相比,其貯藏溫度較低,不會引起食品凍結和營養流失,可以在保持品質的同時延長食品貨架期。冰溫保鮮已在果蔬、海產品等生鮮食品的保鮮中取得了良好效果[12],然而在肉制品中研究還較少。

本試驗以丁香精油為芯材,海藻酸鈉和殼聚糖為復合壁材,利用復凝聚法制備丁香精油微膠囊,采用響應面法研究CaCl2濃度、壁芯比、復合壁材比、包埋時間4個因素對丁香精油微膠囊包埋效果的影響,并將優化得到的丁香精油微膠囊應用于冰溫豬肉的保鮮,為丁香精油在食品保鮮方面的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丁香精油 鄭州雪麥龍食品香料有限公司;新鮮豬后腿肉 楊凌本香農業產業集團有限公司;殼聚糖(脫乙酰度≥90%,食品級) 西安皓源生物技術有限公司;海藻酸鈉、醋酸(食品級) 成都市科龍化工試劑廠;無水乙醇 成都市科隆化學品有限公司。

85-2A數顯恒溫測速磁力攪拌器 金壇市城東新瑞儀器廠;UVmini-1240島津紫外可見分光光度計 日本島津;KR-B型藥物振蕩器 常德市康仁醫療器械有限公司;SB-5200DT超聲清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;ES315高壓蒸汽滅菌鍋 日本Tomy公司;隔水式恒溫培養箱 上海躍進醫療器械廠;SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司;PB-10型pH計 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;半微量凱氏定氮裝置 長天市旭立玻璃儀器廠;噴霧器 余姚市正宇噴霧器廠

1.2 實驗方法

1.2.1 丁香精油微膠囊的制備 參考Otsu等[13]的方法,略有修改。以1%(v/v)醋酸為溶劑配制1%(m/v)的殼聚糖溶液,室溫過夜,加入一定濃度的CaCl2溶液,并用1 mol/L的NaOH溶液調節pH至5.4,記為A液。將1%海藻酸鈉溶液置于60 ℃下,保溫過夜,加入一定比例的稀釋后的丁香精油無水乙醇∶丁香精油=10∶1),60 ℃攪拌20 min,記為B液。趁熱將B液用噴霧器噴入A液中,經一定時間包埋反應(磁力攪拌1000 r/min),尼龍布過濾微膠囊,并用蒸餾水洗滌多余的CaCl2,室溫(25 ℃)下自然晾干12 h,收集微膠囊。

1.2.2 丁香精油標準曲線 用無水乙醇配制不同濃度的(0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24 g/L)丁香精油標準液,在263 nm波長處測定其吸光度。以丁香精油濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制曲線[5]。得到丁香精油濃度對吸光度的標準曲線y=2.7189x+0.0192,R2=0.9918,表明丁香精油在0.04～0.24 g/L范圍內與吸光度線性關系良好,此方程可用來測定丁香精油含量。

1.2.3 單因素實驗 設定初始的基本工藝參數為壁芯比4∶1(m/m),復合壁材比(海藻酸鈉∶殼聚糖)為1∶1(m/m),CaCl2濃度10 g/L,包埋時間30 min,只改變其中一個參數,研究其對丁香花蕾精油包埋率的影響,試驗中固定參數采用上一階段得到的最佳水平。CaCl2濃度選取(以A液記)5、10、15、20和25 g/L;壁芯比9∶1、8∶1、8∶2、8∶3、8∶4和8∶5;復合壁材比分別為3∶5、4∶5、5∶5、6∶5和7∶5;包埋時間15、30、45、60和75 min。

1.2.4 響應面試驗設計工藝參數優化 在單因素實驗基礎上,根據Box-Behnken試驗設計原理,選取CaCl2濃度(A)、壁芯比(B)、復合壁材比(C)、包埋時間(D)四個因素的最優試驗范圍,以微膠囊的包埋率為響應值,設計4因素3水平試驗,確定最佳參數,響應面設計試驗因素水平及編碼如表1。

表1 Bex-Benhenken設計試驗因素及水平編碼Table 1 Factors and levels of codeTable of BBD design

1.2.5 包埋率測定

1.2.5.1 表面油測定 取0.200 g微膠囊,置于10 mL容量瓶中,無水乙醇定容,浸潤5 min,5000 r/min離心10 min,取上清液于263 nm處測定吸光度值,根據丁香精油標準曲線計算表面油含量。

1.2.5.2 總油測定 取0.200 g微膠囊,置于10 mL容量瓶中,無水乙醇定容,60 ℃、300 W超聲60 min,振蕩器振蕩10 min,5000 r/min離心10 min[14],取上清液于263 nm處測定吸光度值,根據丁香精油標準曲線計算總油含量。包埋率按照公式(1)計算。

式(1)

1.2.6 丁香精油微膠囊對冰溫豬肉保鮮效果影響 在無菌操作條件下,將新鮮豬后腿肉去皮去掉筋膜及多余的脂肪,分割成每塊100 g,分別均勻涂抹2%的丁香精油微膠囊溶液(pH=4.1)、不含精油的空芯微膠囊(pH=4.1),對照組涂抹等量的無菌水,瀝干,放入聚酯托盤里用保鮮袋裝好封口,置于-1～0 ℃冰箱中保藏。每隔3 d分別進行感官評定,測定冷卻豬肉的pH、揮發性鹽基氮(TVB-N)、菌落總數,各組處理均設3個平行,評定方法如下。

1.2.6.1 感官評定 參照GB 2707-2016《食品安全國家標準 鮮(凍)畜、禽產品》。樣品從冷藏柜取出后,放置20 min恢復至室溫,由食品相關專業共10名人員對其色澤、氣味、彈性、粘度等指標進行評定,評分標準如表2。

表2 冷卻豬肉感官評分標準Table 2 Sensory evaluation criterion for chilled pork

1.2.6.2 pH 參照GB 5009.237-2016《食品安全國家標準 食品pH的測定》

1.2.6.3 菌落總數 參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》

1.2.6.4 揮發性鹽基氮(TVB-N) 參照GB 5009.228-2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》

1.3 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 CaCl2濃度對丁香精油微膠囊包埋率的影響 由圖1A可知,當CaCl2濃度為5 g/L時,微膠囊粘連較多,不易成型,包埋率較低;10 g/L的CaCl2制備的微膠囊包埋率最高(70.07%),與其他濃度相比,差異顯著(p<0.05)。隨著CaCl2濃度的繼續增加,包埋率逐漸降低。Ca2+濃度增加有利于微膠囊囊壁的形成,提高囊壁的致密程度,但過高的Ca2+濃度則會使乳液中液滴的自由空間減小而易于聚集,最終導致微膠囊包埋率下降。

圖1 CaCl2濃度(A)、壁芯比(B)、復合壁材比(C)和包埋時間(D)對丁香微膠囊包埋率的影響Fig.1 Effects of CaCl2 concentration(A),core-wall ratio(B),ratio of composite wall material(C)and embedding time(D)on embedding rate of clove essential oil microcapsule注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05),相同小寫字母表示差異不顯著(p>0.05)。

2.1.2 壁芯比對丁香精油微膠囊包埋率的影響 圖1B可看出,壁芯比為8∶1 (m/m)時,丁香精油微膠囊的包埋率最高(76.22%),且差異顯著(p<0.05),隨著芯材的增多,包埋率呈下降趨勢。芯材比例的提高在一定范圍內可增加芯壁之間的接觸面積,提高絡合速度,但當芯材含量過高,壁材不能完全吸附芯材而使丁香精油粘附在微膠囊的表面,表面油含量提高,從而降低了包埋率。

2.1.3 壁材比對丁香精油微膠囊包埋率的影響 圖1C可知,壁材比為4∶5 (m/m)時,微膠囊的包埋率最高(78.22%),差異顯著(p<0.05),包埋率呈現出先增大后減小的趨勢。海藻酸鈉溶液含有游離的羧基,性質活潑,帶負電荷,殼聚糖分子結構中存在帶正點的氨基,聚合物離子具有相反的電荷,可通過靜電作用聚合[15]。當混合溶液中離子數量在電學上恰好相等時,得到的丁香精油微膠囊包埋率最高[16]。

2.1.4 包埋時間對丁香精油微膠囊包埋率的影響 由圖1D可知,包埋率隨包埋時間呈現出先增大后減小的趨勢,包埋時間為45 min時,微膠囊包埋率最高(79.68%),并且差異顯著(p<0.05)。起初精油分子與壁材能有充足的時間包埋,提高了包埋率,而已經包埋的精油隨著時間的延長會脫離包埋,使包埋率降低。

2.2 響應面法優化丁香精油微膠囊制備工藝

2.2.1 響應面試驗設計及結果 單因素試驗基礎上,選取CaCl2濃度(A)、壁芯比(B)、復合壁材比(C)、包埋時間(D)4個因素進行響應面試驗,以微膠囊的包埋率為響應值,試驗分析結果見表3。

表3 響應面設計方案與試驗結果Table 3 Design scheme and test results of response surface

2.2.2 模型的建立與響應面分析 以丁香精油微膠囊的包埋率為響應值,利用Design-Expert.V8.0.6軟件對表3進行二次多項回歸擬合和方差分析,得到如下包埋率與不同影響因素之間的二次回歸模型方程與回歸模型方差分析(表4)。

表4 響應面模型方差分析Table 4 ANOVA for response surface quadratic model

Y=-159.31+71.16A+29.40B+138.48C+1.75D+1.79AB+23.18 AC-0.189AD-0.80BC+0.047BD+0.26CD-38.20A2-2.37B2-106.03C2-0.022D2

表4可以看出,模型極顯著(p<0.0001),失擬不顯著(p=0.0727),說明該模型擬合良好,可用于丁香精油微膠囊制備的分析和預測。由方差分析表可知,一次項A、B,二次項A2、B2、C2、D2對丁香精油微膠囊包埋率的影響極顯著(p<0.01),一次項D,交互項AC對丁香精油微膠囊包埋率的影響顯著(p<0.05)，其三維響應面圖見圖2。等高線的形狀表示相互作用的強弱,如果等高線圖趨于橢圓形,則交互作用明顯,若趨于圓形,則交互作用較弱[17]。另外,如果一個響應面的坡度趨于陡峭,表明因素條件對響應值的影響較大,反之,因素條件對響應值的影響較小[18]。由圖2可知,CaCl2濃度與復合壁材比兩者的交互作用最強。CaCl2濃度與壁芯比對丁香精油包埋率的影響較大,其他因素的影響相對較小。

圖2 兩因素交互作用對包埋率影響的響應面Fig.2 Response surface of the interaction of two factors on the embedding rate

2.2.3 優化工藝參數與模型驗證 結合回歸模型,得到響應面優化制備丁香精油微膠囊的最佳工藝條件為:CaCl2濃度12.30 g/L,壁芯比6.99∶1 (m/m),復合壁材比為0.82∶1 (m/m),包埋時間47.22 min,微膠囊包埋率預測值為85.22%。為進一步驗證模型預測的準確性,同時考慮便于實際操作,將微膠囊的工藝條件修正為:CaCl2濃度12 g/L,壁芯比7∶1 (m/m),復合壁材比0.8∶1 (m/m),包埋時間47 min。

用修正后的條件進行3次驗證性試驗,得到的丁香精油微膠囊平均包埋率為84.20%,與方程得到的預測值相對偏差為2.52%,表明該模型預測性好,具有較好的適用性。本試驗制備的丁香精油微膠囊包埋率遠高于高凱等利用飽和水溶液法,以β-環糊精為壁材制備的丁香精油微膠囊的包埋率67%[19],原因在于試驗對壁材進行了改進,選用了海藻酸鈉與殼聚糖兩種帶有相反電荷的聚電解質作為復合壁材,并且利用復凝聚法,使水溶液中的復合壁材在靜電作用下,將芯材包覆形成微膠囊,丁香精油被海藻酸鈉與殼聚糖之間形成的復雜網狀結構包裹[20],密封性好,包埋率較高。該方法適于對芯材為非水溶性的固體粉末或液體的包埋[21],尤其是一些不穩定的物質,是一種高產率和高效率的包埋方法,所制備的微膠囊粒徑均一,在農業領域有著光明的前景[16]。

2.3 丁香精油微膠囊對冰溫豬肉保鮮效果的影響

2.3.1 丁香精油微膠囊對冰溫豬肉感官品質的影響 感官評定是衡量鮮肉品質直接、重要的指標,在消費者購買豬肉時起著決定性作用。試驗認為當豬肉樣品各項感官評分之和等于或小于12分時,豬肉已經沒有食用價值。感官評價中發現補充丁香精油微膠囊后不會產生令人不愉悅的異味,在風味上可以被廣大的消費者接受。對照組存放到第9 d,表面黏液增多,略有異味,第12 d顏色變暗,氣味難聞,第15 d異味更加嚴重,彈性完全消失,不能接受?？招窘M和精油組豬肉仍有較好的色澤、氣味、彈性和粘度,保持著較好的新鮮度;豬肉經微膠囊處理后,顏色會稍白一些,一周后顏色漸漸恢復正常,總體評分上丁香精油微膠囊最優,空芯微膠囊次之,對照組最低(圖3)。

圖3 丁香精油微膠囊對冰溫豬肉感官評分的影響Fig.3 Effects of clove essential oil microcapsule on sensory score of pork under ice-temperature注:圖中不同字母表示不同保鮮劑處理在同一貯藏時間 于0.05水平差異顯著;圖4～圖6同。

2.3.2 丁香精油微膠囊對冰溫豬肉pH的影響 肉類產品動物死亡后,蛋白質會自溶降解生成堿性的胺類物質,糖類則經糖酵解生成乳酸等酸性物質,因此肉類產品的pH變化可以反應其腐敗程度[22]。試驗初期,空芯組與精油組豬肉的pH均呈現先降低的趨勢(圖4),推測應與保鮮劑本身pH較低有關。隨著貯藏時間的延長,微生物分解蛋白質不斷生成生物胺和一些堿性物質,肉樣中的酸性物質被中和,堿性物質不斷累積,因此3組豬肉樣品的pH均緩慢升高。新鮮肉的pH一般在5.8～6.2,正常鮮肉的pH應低于6.2[23]。對照組豬肉的pH在第15 d時達到6.27,超過6.2;空芯組豬肉的pH在第24 d時超過6.2,證明了殼聚糖與海藻酸鈉在一定程度上可以抑制微生物的生長;丁香精油的添加,可較長時間抑制微生物活動,顯著延緩了豬肉pH的升高(p<0.05),第34 d時豬肉樣品變質。

圖4 丁香精油微膠囊對冰溫豬肉pH的影響 Fig.4 Effects of clove essential oil microcapsule on pH of pork under ice-temperature

2.3.3 丁香精油微膠囊對冰溫豬肉菌落總數的影響 菌落總數是用來判定食品被細菌污染程度以及衛生質量的指標。由于鮮肉的自溶,營養物質變得更易獲取,細菌數量也隨之增加。豬肉降解過程初期是由內源性肌酶引起,后期則依賴于微生物酶[24]。不同處理冷卻豬肉菌落總數的變化如圖5所示,可以看出,空芯組與精油組冷卻豬肉菌落總數均呈現出先下降后上升的趨勢,說明空芯微膠囊與丁香精油微膠囊均有一定的抑菌作用。當菌落總數超過6lg CFU/g 時,豬肉判斷為不新鮮[25]。對照組豬肉菌落總數先是平穩增長,冷藏12 d后急劇增長,在第15 d時菌落總數已達6.34lg CFU/g,超過上限;空芯微膠囊組菌落總數在第24 d達到6.29lg CFU/g,超過上限;冷藏第9 d開始,精油組的菌落總數顯著低于空芯組和對照組(p<0.05),在前25 d都能很好地抑制微生物生長,菌落總數基本保持在5lg CFU/g及以下,第25 d之后,菌數急劇增長,第34 d達到6.35lg CFU/g,說明丁香精油微膠囊可有效抑制微生物繁殖,延緩冷卻豬肉的腐敗變質。這可能是所制備的丁香精油微膠囊具有緩釋效果,冷卻豬肉儲藏期間丁香精油持續緩慢釋放的結果。以菌落總數為評價標準,冰溫條件下對照組、空芯組與精油組冷卻豬肉分別可保鮮12、21和27 d。

圖5 丁香精油微膠囊對冰溫豬肉菌落總數的影響Fig.5 Effects of clove essential oil microcapsule on total bacterial count of pork under ice-temperature

2.3.4 丁香精油微膠囊對冰溫豬肉TVB-N的影響 TVB-N是評價肉類鮮度的常用的重要指標之一,國家標準規定鮮肉TVB-N≤15 mg/100 g[26]。圖6為貯藏過程中各處理組冷卻豬肉TVB-N的變化,不同處理豬肉的TVB-N值隨著儲藏時間的延長逐漸增大,這主要是在酶和微生物的作用下,肉中蛋白質分解產生了氨和胺類等堿性含氮物質。由圖6可知,對照組樣品的TVB-N值始終高于空芯組與精油組,空芯組與精油組豬肉的TVB-N增長較為緩慢。對照組冷卻豬肉TVB-N在第12 d時已經達到16.18 mg/100 g,最先超過標準,說明對照組可保鮮9 d。第6 d開始處理組樣品的TVB-N顯著低于對照組(p<0.05),第18 d開始,精油組的TVB-N顯著低于空芯組(p<0.05),說明空芯微膠囊處理有利于延緩豬肉TVB-N值的升高,而丁香精油微膠囊處理效果更明顯?？招窘M和精油組豬肉的TVB-N分別在第24和第34 d超過國家規定的鮮肉標準,說明冰溫條件下，空芯組和精油組冷卻豬肉分別可保鮮21和27 d。

圖6 丁香精油微膠囊對冰溫豬肉TVB-N的影響Fig.6 Effects of clove essential oil microcapsule on TVB-N of pork under ice-temperature

關于丁香精油的研究多見于對水果和糧食保鮮的研究,肉與肉制品的研究還較少。劉占東等[27]利用包埋質量分數1.0%肉桂精油的肉桂精油殼聚糖納米粒處理冷卻肉,使其在(4±0.5) ℃下儲藏期可達到6 d;顧仁勇等[28]發現利用9%牛至精油+9%丁香精油+9%山蒼子精油+9%肉桂精油的復合保鮮劑,結合真空包裝技術,能使豬肉冷藏(0～4 ℃)時間達18 d。本實驗冷卻豬肉保鮮期可達30 d,原因一在于對丁香精油進行了微膠囊處理,微膠囊的緩釋作用延長了其抑菌的時間;二是本試驗所用壁材具有抗菌作用,與丁香精油協同發揮了作用;三是本試驗采用冰溫條件貯藏冷卻豬肉,較普通冷藏溫度更低,在確保冷卻豬肉不被凍結的情況下能更好地抑制微生物的生長繁殖。

3 結論

本研究通過響應面法優化表明,CaCl2濃度,壁芯比,包埋時間以及CaCl2濃度和復合壁材比的交互作用對丁香精油微膠囊的包埋率影響顯著,調整后條件CaCl2濃度12 g/L,壁芯比7∶1,復合壁材比0.8∶1,包埋時間47 min,此條件下丁香精油微膠囊包埋率為84.20%,相對誤差小于5%,模型較為合理。冰溫下對照組、空芯組以及精油組的豬肉可分別保鮮9、21和27 d。試驗所制備的丁香精油微膠囊可顯著延長冰溫豬肉的保鮮期,在本試驗基礎上再結合保鮮袋、氣調等其他的保鮮技術,預計豬肉保鮮時間還會更長。