大黃中抗氧化物質的提取工藝優(yōu)化

袁詩俊,龔夢瑀,李夢林,順遠楓,黃 毅

(西南科技大學生命科學與工程學院,四川綿陽 621010)

自由基是單質或化合物均裂產生的帶有未成對電子的原子或基團,研究表明其與多種疾病的發(fā)生有密切的關系[1]，能夠有效抑制自由基的產生有助于有效地預防,延緩甚至治愈,如阿爾茲海默病[2]、慢性支氣管炎[3]和青光眼[4]等疾病。因此,近年來,抗氧化物質,特別是天然產物來源的抗氧化物質的開發(fā)成為研究熱點。大量的化妝品中添加植物抗氧化劑,對抗自由基引起的皮膚衰老[5]。很多天然食品或藥品如葡萄、虎杖和桑椹中的白藜蘆醇等早已作為膳食補充劑,用于保健及疾病預防[6]。

大黃(Rhubarb)是蓼科大黃屬植物的干燥根莖,為我國常用中藥材，其臨床應用廣泛,具有顯著止瀉、抗腫瘤和腦保護等效果。近年來,大黃抗氧化作用也受到了廣泛關注,其所含大黃酸[7]、大黃素[8]等蒽醌類衍生物以及鞣質等能直接對抗自由基損傷細胞的效果,有利于機體機能修復及細胞的抗衰老,對于其他藥用功效也有較強的輔助效果。

本課題組在對傳統(tǒng)中藥材抗氧化能力的初步篩選系列工作中,發(fā)現(xiàn)大黃具有非常強的抑制自由基活性。現(xiàn)有文獻對其抗氧化活性的物質基礎并不完全清晰,提取方面的報道更是著重某一化學類別物質的工藝優(yōu)化而非以活性為檢測指標,如蒽醌類[9]或多糖類[10]等。為了促進大黃作為天然抗氧化保健藥食品的開發(fā)以及其抗氧化活性物質的后續(xù)分離工作,本文采用正交試驗對大黃抗氧化活性物質的提取工藝進行研究,優(yōu)化提取方案。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大黃(產地青海,批號 160901)藥材飲片 于2017年購自四川綿陽桐君閣大藥房,經鑒定為蓼科大黃屬植物藥用大黃(RheumofficinaleBaill)的干燥根莖,藥材經60 ℃烘干,粉碎過50目篩,4 ℃避光干燥保存?zhèn)溆?整個提取工藝優(yōu)化實驗在1月內完成;DPPH(1,1-二苯-2-苦肼自由基) 梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;無水乙醇 成都市科龍化工試劑廠;以上試劑 均為分析純；純水 為實驗室自制(電阻率為18 MΩ·cm)。

7200型可見光分光光度計 龍尼柯(上海)儀器有限公司;小型中藥材粉碎機 上海淀久中藥機械廠;XH-C型渦旋混合器 金壇市天竟實驗儀器廠;D1008E型小型離心機 美國Scilogex有限公司;KQ-200KDE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;BSA124S型電子天平 德國賽多利斯有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大黃中抗氧化物質的提取 采用超聲輔助提取(功率恒定為200 W),準確稱取500 mg大黃藥材粉末于具塞錐形瓶中,加入10 mL無水乙醇,封口并記錄瓶重,超聲提取10 min后,按記錄重量補足溶劑,將提取液于10000 r/min離心1 min,取上清液用于抗氧化活性檢測。

1.2.2 單因素實驗 影響提取效果的因素主要包括乙醇濃度,浸提溫度,提取時間和固液比,通過預實驗發(fā)現(xiàn)浸提溫度對提取物抗氧化活性影響不大,因此選取剩余三因素進行單因素實驗。以DPPH自由基的清除率作為考察指標,固定提取時間為10 min,固液比為1∶10條件下考察了乙醇濃度100%、80%、60%、40%和20%對抗氧化物質提取的影響;固定乙醇濃度為100%,固液比為1∶10,考察浸提時間10、30、50、70和90 min對抗氧化物質的提取影響;固定乙醇濃度100%,浸提時間10 min,考察固液比為1∶90、1∶70、1∶50、1∶30、1∶10對大黃中抗氧化活性物質提取的影響。為保證固液比測定的準確性,不同固液比提取的最終溶液均稀釋到相同濃度進行抗氧化活性比較。

1.2.3 正交試驗 參考報道[11]文獻,在各單因素實驗的自由基清除率極大值附近選取三個水平,以DPPH自由基清除率為指標,設計3因素3水平正交表L9(34)進行正交試驗,優(yōu)化大黃中抗氧化活性成分的提取工藝。

表1 L9(34)正交實驗因素與水平Table 1 Factors and levels in the L9(34)orthogonal test

1.2.4 DPPH抗氧化活性檢測 抗氧化活性測定包括DPPH法、羥基自由基、超氧陰離子自由基、總還原力和鐵螯合能力測定等多種方法,在預實驗中筆者發(fā)現(xiàn)以上方法結果具有一致性。為方便工藝研發(fā)中活性的快速跟蹤,本實驗選用了較為簡便的DPPH自由基清除率實驗來進行抗氧化活性判定。采用Pyrzynska等[12]報道的方法略作修改,準確移取200 μL樣品溶液與4 mL DPPH溶液(30μg/mL,由無水乙醇配制,該溶液在517 nm處吸光度值約為0.8)于試管中,渦旋混勻后避光5 min,10000 r/min離心1 min,取上清液轉入比色皿,室溫下測定517 nm處吸收值。該值伴隨自由基清除劑量的增多而減弱,樣品抗氧化能力可用清除率(Scavenging rate,簡寫為SR%)來表示,計算公式如下:

SR(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

式中:Ai為0.2 mL測試溶液與4 mL DPPH溶液混合后的吸光度值;Aj為0.2 mL測試溶液與4 mL無水乙醇溶劑混合后的吸光度值;A0為0.2 mL制備測試溶液時所用溶劑與4 mL DPPH溶液混合后的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗平行測定3次,單因素實驗結果用平均值±SE表示,正交實驗結果用平均值表示,采用SPSS 20.0軟件進行ANOVA分析(顯著性水平p<0.05)。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度 由圖1可知,乙醇濃度小于60%時,自由基清除率緩慢提高。伴隨乙醇濃度的繼續(xù)上升,清除率大幅下降。可推斷大黃中抗氧化活性物質主要為親水性化合物,其更易溶于水而非乙醇。在后續(xù)正交試驗中乙醇濃度這一因素選擇40%、60%和80% 這3個水平進行正交試驗。

圖1 乙醇濃度對清除率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on clearance rate

2.1.2 提取時間 由圖2可知,提取時間對抗氧化活性的影響呈鐘形分布。提取開始后,伴隨時間延長,溶劑充分浸透大黃粉末,促進了顆粒中抗氧化物質的充分溶出,使得清除率增加,抗氧化活性升高，到30 min時清除率基本達到最大值,此后,自由基清除率反而伴隨時間延長而下降,原因可能是超聲時間過久,超聲波的空化效應和熱效應都會破壞抗氧化活性物質的結構[13]。后續(xù)正交試驗中提取時間選取10、30和50 min 3個水平進行正交試驗。

圖2 提取時間對清除率的影響Fig.2 Effect of extraction time on clearance rate

2.1.3 固液比 由圖3可知,固液比在1∶10～1∶30(即樣品濃度大于33 mg·L-1)時,DPPH的清除率隨著溶劑占比的增加而增大,說明伴隨溶劑量的增加,樣品中抗氧化活性物質與溶劑接觸面積增加,使得更多的抗氧化活性物質有效溶出，但當固液比達到1∶30并繼續(xù)增加溶劑量時,提取液對DPPH自由基的清除率并未繼續(xù)上升而是基本保持恒定狀態(tài)。鑒于溶劑用量過大會造成成本上升,因此選取1∶10、1∶30和1∶50這3個水平進行正交試驗。

圖3 固液比對清除率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on clearance rate

2.2 正交實驗及驗證

正交試驗結果及分析見表2和表3,極差R值反應出,影響大黃提取物的抗氧化活性的因素由主到次依次為A時間>B乙醇濃度>C固液比。A因素第2水平的均值最大,故因素A的優(yōu)選水平為2,同理因素B和C的優(yōu)選水平均為2。所以本實驗的最佳工藝條件為A2B2C2,即提取時間為30 min,乙醇濃度為60%,固液比為1∶30。

表2 正交試驗結果及極差分析Table 2 Orthogonal test results and range analysis

表3 方差分析表Table 3 Variance analysisTable

根據(jù)以上最優(yōu)條件:提取時間30 min,乙醇濃度60%和固液比為1∶30進行最優(yōu)工藝驗證,3組平行實驗得到的結果為96.02%±1.36%,該結果符合預期且優(yōu)于以上所有水平表現(xiàn),表明該優(yōu)化參數(shù)可行。

3 結論

由于抗氧化活性物質種類多樣,已報道的工藝開發(fā)方法雖然明確了化合物類別,但提取時容易遺漏具有抗氧化活性的其他類成分。本研究以生物活性為指標進行工藝優(yōu)化避免了以上問題的出現(xiàn)。最終,通過單因素和正交試驗,以提取物對自由基的清除率為指標,得到大黃抗氧化活性物質的最佳提取條件為提取時間30 min、乙醇濃度60%和固液比為1∶30,此時其自由基清除率可達96.02%±1.36%,該工藝可為大黃作為保健藥食品的開發(fā)利用提供一定的理論和應用依據(jù)。