山楂荷葉復合固體飲料的制備工藝優化 及功能性成分含量測定

余婷婷,張 顯,郟文青,張 嬌,魏 屹,*

(1.西南交通大學生命科學與工程學院,四川成都 610031; 2.瀘州百草堂健康產品有限公司,四川瀘州 646000)

高脂血癥(HLP)又稱高脂蛋白血癥或血脂異常,與高血壓、高血糖并稱“三高”,是中老年常見病及多發病[1],其所引起的動脈粥樣硬化是造成冠心病、高血壓和腦血管疾病的主要原因[2]。目前,國內外對高脂血癥主要采用藥物治療,但藥物都有不同程度的毒副作用,且高脂血癥發病率逐年增高,發病年齡也趨向年輕化,因此,開發降脂保健食品，變治病為防病,有著重要的社會意義[3]。

衛生部認定的藥食兩用藥材名錄中,有許多具有降低血脂的作用,如山楂、荷葉、銀杏葉、絞股藍、葛根、昆布、三七等,均可作為保健食品或其原料進行開發,但目前并未充分開發利用,且已開發的許多降脂保健食品并無質控標準或質控標準單一[4-5]。當前市面上的保健食品仍以膠囊、片劑、口服液為主流劑型[6],而固體飲料作為新興的保健食品劑型,具有攜帶方便、保質期較長等優點,更適合中老年人攜帶及服用,有著巨大的市場潛力[7]。

本研究以藥食兩用的山楂、荷葉、萊菔子、昆布為主要原料,擬主要采用正交試驗設計法,優選出經濟、可行的提取工藝,按照一定比例復配成一種固體飲料。該飲料降脂作用的主要藥效活性成分為黃酮類和生物堿類物質,其中,黃酮類物質為方中君藥山楂、荷葉主含有,含量較高,降脂效果良好[8-11],是目前許多降脂保健食品的質控指標[12];而荷葉堿為方中君藥荷葉所獨有,化學性質較穩定,具有功效相關的調節血脂[13-15]、抗動脈粥樣硬化[16]等作用,且含量測定方法較為成熟,因此,本文選擇以總黃酮含量和荷葉堿含量作為功能性指標,并分別采用紫外分光光度法和高效液相色譜法，建立總黃酮及荷葉堿的含量測定方法,從而為本品的質量控制提供更加科學的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荷葉堿對照品(批號:CHB151013) 成都克洛瑪生物科技有限公司;蘆丁對照品(批號:10080-201408) 中國食品藥品檢定研究院;山楂、荷葉、萊菔子、昆布 市售,經西南交通大學生命科學與工程學院宋良科教授鑒定,分別為薔薇科植物山里紅CrataeguspinnatifidaBge.var.major N.E.Br.或山楂CrataeguspinnatifidaBge.的干燥成熟果實、睡蓮科植物蓮NelumbonuciferaGaertn.的干燥葉、十字花科植物蘿卜RaphanussativusL.的干燥成熟種子和海帶科植物海帶(LaminariajaponicaAresch.)或翅藻科植物昆布(EchloniakuromeOkam.)的干燥葉狀體;乙腈(色譜純) 美國Sigma公司;其他試劑 均為國產分析純。

Waters e2695高效液相色譜儀,Waters 2998二極管陣列檢測器,Waters XbridgeTMC18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm) 沃特世(Waters)科技有限公司;UV-9000S紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;SHIMADZU AUY220分析天平 日本島津公司;KQ-250DE 超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司;DZF-6090真空干燥箱 上海精宏試驗設備有限公司;DK-98-1電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;RE-52AA旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 復合固體飲料的制備工藝 根據藥典關于藥材用量規定[17]和保健食品原料管理辦法[18],結合處方中各味藥材的藥理作用,即以山楂、荷葉為降脂君藥,輔以萊菔子降氣平喘消食之效以及昆布清熱散結,利水消腫之功,配以卵磷脂矯色之用,參考合作企業生產實踐預用量等得到復合固體飲料的配方質量比如下,山楂:荷葉提取物∶萊菔子提取物∶昆布∶卵磷脂=1∶1∶1∶3∶1。

根據藥物有效成分的理化性質,結合臨床需求、生產可行性及生產設備要求等因素,擬通過正交試驗設計,對荷葉和萊菔子有效成分的提取工藝進行優化,其中,生物堿類較易溶于水,黃酮類成分較易溶于乙醇、甲醇等極性溶劑中,考慮食用安全性,分別選擇水和乙醇為溶劑提取萊菔子和荷葉的有效成分,同時綜合處方中其他藥材性質、藥理作用和保健食品劑型,設計制備工藝如下:

山楂藥材粉碎過100目篩,得山楂粉末;荷葉以一定濃度乙醇溶液于一定溫度下回流提取一定時間，得荷葉醇提液,經60 ℃減壓濃縮成膏后,于真空度-0.09 MPa、溫度60 ℃下減壓干燥12 h,粉碎過100目篩,得荷葉黃酮提取物粉末;萊菔子以一定體積比的水為溶劑提取一定時間，得萊菔子水提液,經60 ℃減壓濃縮成膏后,于真空度-0.09 MPa、溫度60 ℃下減壓干燥12 h,粉碎過100目篩,得萊菔子提取物粉末;昆布于80 ℃干蒸20 min后,粉碎過100目篩,得昆布粉末。將上述山楂粉末、荷葉黃酮提取物粉末、萊菔子提取物粉末、昆布粉末等按配方質量比混勻,過100目篩,即得復合固體飲料。

1.2.2 荷葉黃酮提取工藝正交試驗設計 在參考相關文獻單因素試驗基礎上[19-20],以綜合評分為評價指標,固定提取次數2次,選定乙醇濃度(A),液料比(B)、提取時間(C)、提取溫度(D)4因素,每個因素選定3個水平進行L9(34)正交試驗,因素水平見表1。

表1 荷葉黃酮提取正交因素水平設計Table 1 Orthogonal factor and level of lotus leaf flavonoids extraction

1.2.3 萊菔子提取物制備正交試驗設計 在參考相關文獻單因素試驗基礎上[21-22],以水溶性生物堿的雷氏鹽沉淀量及干膏得率為評價指標,選定提取次數(A)、液料比(B)、提取時間(C)3因素,每個因素選定3個水平進行L9(34)正交試驗,因素水平見表2。

表2 萊菔子提取物制備正交因素水平設計Table 2 Orthogonal factors and levels of radish seed extraction

1.2.4 干膏得率測定方法 參考相關文獻[23],按下式計算荷葉醇提液或菜菔子水提液干膏得率。

干膏得率(%)=(M1-M0)/m×100

式中,M1為干膏與蒸發皿總重(g);M0為空蒸發皿重量(g);m為提取藥材質量(g)。

1.2.5 水溶性生物堿含量測定方法 參考相關文獻[24],精密量取濃縮液5 mL,采用鹽酸調節pH,約2～3左右即可,過濾除去沉淀,加入過量配制好的雷氏鹽溶液,過濾,用少許水沖洗沉淀,放進烘箱里面,干燥至質量恒定,精密稱定,按下式計算雷氏鹽沉淀量。

雷氏鹽沉淀量(mg/g)=(m-m0)×(V0/V)/W×1000

式中:m為沉淀與濾紙的總重量(g),m0為濾紙的重量(g),V為量取的濃縮液的體積(mL),V0為總濃縮液的體積(mL),W為稱取的藥材的質量(g)。

1.2.6 總黃酮含量測定方法 參考相關文獻[25-26],繪制總黃酮標準曲線及測定含量。

1.2.6.1 標準曲線的繪制 取蘆丁對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含0.24 mg的溶液,即得蘆丁對照品溶液。精密量取蘆丁對照品溶液(0.24 mg/mL)0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL,分別置于25 mL容量瓶中,各加水至12 mL,精密加入5% NaNO2溶液1.0 mL,搖勻,靜置6 min,精密加入10% Al(NO3)3溶液1.0 mL,搖勻,靜置6 min,加入4%NaOH溶液8.0 mL,用蒸餾水分別補足至刻度,搖勻放置10 min。置1 cm比色皿中,按紫外-可見分光光度法,以零管為空白,在510 nm波長處測定吸收度,平行測定3次,取平均值,以吸光度為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制標準曲線。

1.2.6.2 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的樣品溶液(20170608)1 mL，平行6份，依次精密加入蘆丁對照品溶液(0.24 mg/mL)1 mL，按1.2.6.1項下條件測定吸光度值。

1.2.6.3 樣品測定 稱取復方固體飲料粉末約1.0 g,精密稱定,置圓底燒瓶中,精密加入30倍量的70%乙醇,稱定重量,置80 ℃水浴中回流提取1.5 h后，取出冷卻,再稱定重量,用70%乙醇補足減失的重量,搖勻,過濾,濾液轉移至50 mL容量瓶中,加70%乙醇至刻度,搖勻。精密量取1 mL,置25 mL量瓶中,按1.2.6.1項下方法操作,測定吸光度值,計算,即得?？傸S酮含量計算公式如下:

總黃酮含量(%)=C×V×D/W×100

式中,C為提取液中總黃酮濃度;V為提取液體積;D為稀釋倍數;W為原料質量。

1.2.7 荷葉堿含量測定方法 參考相關文獻[27-29],繪制荷葉堿標準曲線及測定含量。

1.2.7.1 色譜條件 色譜柱:Waters XbridgeTMC18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:乙腈-水-二乙胺-冰醋酸(27∶70.6∶1.6∶0.8);檢測波長:270 nm;流速:1 mL/min。理論板數按荷葉堿峰計算應不低于2000。

1.2.7.2 溶液的制備 對照品溶液的制備:取荷葉堿對照品適量,精密稱定,加甲醇制成濃度為60 μg/mL的荷葉堿對照品儲備液及濃度為15 μg/mL的荷葉堿對照品溶液。

供試品溶液的制備:取復方固體飲料粉末約1.0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50 mL,稱定重量,超聲(200 W,40 kHz)30 min后取出,冷卻,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,過濾,精密量取續濾液5 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,以0.45 μm濾膜濾過,即得。

陰性對照品溶液的制備:取1.0 g按處方比例及制備工藝制備的不含荷葉的陰性樣品,按供試品的制備方法制成陰性對照品溶液。

1.2.7.3 陰性干擾考察 精密吸取陰性對照溶液、對照品溶液和供試品溶液各20 μL,按1.2.7.1色譜條件進行測定。

1.2.7.4 線性關系考察 精密量取1.2.7.2項下制備的荷葉堿對照品儲備液(60 μg/mL)0.25、0.5、1、2、2.5、3、4 mL,分別定容至10 mL,得到濃度為1.5、3.0、6.0、12.0、15.0、18.0、24.0 μg/mL的荷葉堿標準品溶液,按1.2.7.1項下色譜條件進樣,進樣量為20 μL,記錄色譜圖。

1.2.7.5 加樣回收率試驗 取已知荷葉堿含量的復方固體飲料粉末6份，各約0.5 g，分別精密加入荷葉堿對照品儲備液3.4 mL后，按1.2.7.2項下方法制備成6份供試品溶液，各取20 μL按1.2.7.1項下色譜條件進樣測定，分別測定峰面積。

1.2.7.6 樣品測定 分別取3批固體飲料樣品,按1.2.7.2項下方法制備供試品溶液,按上述1.2.7.1項下色譜條件進樣測定,進樣20 μL,每批平行3份測定。

1.3 數據統計分析

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據的處理與分析。文中涉及的綜合評分計算公式如下:

綜合評分Z=(X/Xmax)×50+(Y/Ymax)×50

式中,X為總黃酮含量或雷氏鹽沉淀量,Xmax為總黃酮含量或雷氏鹽沉淀量的最大值;Y為干膏得率,Ymax為干膏得率最大值。各計為50分。

2 結果與分析

2.1 荷葉黃酮提取工藝正交試驗結果

由表3的正交試驗結果可知，4種因素對荷葉黃酮提取物綜合評分的影響力大小順序為D>A>B>C，即提取溫度>乙醇濃度>液料比>提取時間，A2B3C3D3的綜合評分最高，此時乙醇濃度為80%，液料比為60 mL/g，提取時間為2.5 h，提取溫度80 ℃，在此條件下進行3次重復實驗，得綜合評分為98.41，總黃酮含量為7.68%，RSD=1.13%，干膏得率為23.58%，RSD=0.59%。由表4可知，4種因素中，乙醇濃度對荷葉黃酮提取物綜合評分的影響顯著(p<0.05)，提取溫度對對荷葉黃酮提取物綜合評分的影響極顯著(p<0.01)，因此在實際操作中，需注意對此二因素的嚴格把控。

表3 荷葉黃酮提取工藝正交試驗結果Table 3 Orthogonal test of lotus leaf flavonoids extraction process

表4 荷葉黃酮提取工藝方差分析Table 4 Analysis of variance of lotus leaf flavonoids extraction process

2.2 萊菔子提取物制備正交試驗

根據表5的正交試驗結果可知，3因素對萊菔子提取物的綜合評分的影響力大小順序為A>B>C，即提取次數>液料比>提取時間，A3B2C3的綜合評分最高，但根據表6的方差分析結果可知，此范圍的液料比與提取時間對萊菔子提取物的綜合評分無顯著性影響，因此，結合實際情況，為提高提取效率，縮短提取時長，選取提取時間為2水平，選擇最終工藝條件為A3B2C2，即提取次數為3，液料比為10 mL/g，提取時間為1.5 h，在此條件下，獲得的萊菔子提取物的綜合評分為98.82，萊菔子干膏得率為23.17%，RSD=0.86%，雷氏鹽沉淀量為49.1018 mg/g，RSD=0.21%。

表5 萊菔子提取物制備正交試驗結果Table 5 Orthogonal test results of radish seed extraction process

表6 萊菔子提取物制備方差分析Table 6 Analysis of variance of radish seed extraction process

2.3 總黃酮的含量測定結果

2.3.1 標準曲線 以蘆丁質量濃度C(mg·mL-1)為橫坐標,吸光度A為縱坐標,根據測定結果進行線性回歸,得回歸方程為:y=5.9702x-0.0046(r=0.9996),表明蘆丁在0.0192～0.1152 mg/mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.3.2 加樣回收率試驗結果 計算得加樣回收率值分別為99.87%、101.29%、98.13%、100.29%、102.38%、101.17%，平均值為100.53%，RSD值為1.45%，方法準確度良好。

2.3.3 總黃酮含量測定結果 由表7可得,3批固體飲料的總黃酮含量為6.18%～6.42%,均值為6.29%，通過與參考文獻對比發現[25-26],所含總黃酮含量高于文獻記錄的其他降脂保健中成藥和保健食品。

表7 復合固體飲料的總黃酮含量測定結果(n=3)Table 7 Results of contents determination of total flavonoids in solid beverage(n=3)

2.4 荷葉堿的含量測定結果

2.4.1 陰性干擾考察結果 供試品中荷葉堿色譜峰與相鄰色譜峰達到了基線分離,理論塔板數按荷葉堿峰計算不低于2000,分離度>1.5,陰性無干擾。結果見圖1。

圖1 荷葉堿高效液相色譜圖Fig.1 HPLC Chromatograms of nuciferine注：A.荷葉堿對照品;B.復合固體飲料樣品;C.陰性對照。

2.4.2 線性關系考察結果 以荷葉堿對照品的峰面積為縱坐標,進樣濃度為橫坐標,得線性回歸方程為y=98520x-6501.1,r=0.9999,表明荷葉堿在1.5～24.0 μg/mL的范圍內呈良好的線性關系。

2.4.3 加樣回收率試驗結果 計算得加樣回收率值為101.49%、99.26%、100.31%、101.06%、98.33%、100.53%，平均值為100.16%，RSD值為1.17 %，方法準確度良好。

2.4.4 荷葉堿含量測定結果 由表8可得,三批固體飲料的荷葉堿含量為1.58～1.66 mg/g,均值為1.63 mg/g,通過與參考文獻對比發現[27-29],所含荷葉堿含量高于文獻記錄的其他降脂保健中成藥和保健食品。

表8 復合固體飲料的荷葉堿含量測定結果(n=3)Table 8 Results of content determination of nuciferine in solid beverage(n=3)

3 結論

本研究通過正交試驗得到荷葉和萊菔子的最佳提取工藝如下:荷葉的提取工藝為60倍80%乙醇于80 ℃下提取2次,每次2.5 h;萊菔子的提取工藝為10倍量水煎煮提取3次,每次1.5 h。經工藝驗證,荷葉干膏得率為23.58%,荷葉黃酮含量為7.68%,萊菔子干膏得率為23.17%,水溶性生物堿雷氏鹽沉淀量為49.1018 mg/g,提取效果較好,可為企業的實際生產提供科學依據。

本研究建立的功能性指標成分總黃酮和荷葉堿的含量測定方法,簡便、準確、重復性好,可為產品的質量控制及評估提供相對全面的依據。本研究測定得到的三批樣品的總黃酮含量均值為6.29%,荷葉堿含量均值為1.63 mg/g,總黃酮含量以及荷葉堿含量均高于文獻記錄的其他降脂保健中成藥和保健食品,單從總黃酮和荷葉堿的含量角度來說,比市場上其他降血脂保健食品更具優勢,有很好的后續研究意義,也為企業的規模生產提供研究基礎。