南方刺參性腺多肽酶解工藝優化 及抗氧化活性分析

徐仰麗,葉 劍,余 海,蘇來金,*

(1.溫州科技職業學院,溫州市農業科學研究院,浙江溫州 325006; 2.蒼南縣漁業技術推廣站,浙江溫州 325802)

刺參(Apostichopusjaponicus),又稱刺參、灰刺等,隸屬于棘皮動物門(Echinodermata)、海參綱(Holothuroidea)、楯手目(Aspidochirotida)、刺參科(Stichopodidae)、刺參屬(Apostichopus),在北方沿海地區廣為分布[1],隨著刺參人工育苗、養殖技術日趨成熟,刺參養殖產業在全國快速發展,成為我國水產養殖業中產值、利潤最高的產業之一,并帶動形成了育苗、養殖、加工產業鏈的完善[2]。自2006年刺參南移成功以來,南方刺參養殖產業也逐漸趨于穩定,2017年南方刺參產量2.65萬噸,占全國的12.97%[3],鹽漬刺參、淡干刺參、即食刺參等產品加工技術也在不斷進步[4],但是刺參加工產業配套技術尚未成熟,刺參精深加工仍處在起步階段[5]。

刺參性腺是刺參卵和刺參精的統稱,研究表明,刺參性腺具有豐富的營養成分,還含有多糖、皂苷等活性成分[6-11],在北方刺參加工中,加工者已經開始收集海參性腺進行銷售或者再加工,但在南方刺參粗加工中,刺參性腺作為廢棄物直接丟棄,既造成資源浪費,也造成了環境的污染。研究表明,刺參通過酶解制成的刺參肽具有較好的活性[12-15],刺參性腺蛋白含量高,含有諸多活性成分[16],但有關刺參性腺的綜合利用研究不多,南方刺參性腺的研究尚未見報道,其中的差異未知,因此開展南方刺參性腺酶解的綜合利用,有助于減少污染,提升副產物附加值,促進養殖增收增效。

本研究以南移養殖刺參的性腺為原料,以多肽得率為評價指標,優化了內切性Protamex復合蛋白酶催化酶解刺參性腺的最佳的工藝,并利用該工藝對南、北方養殖刺參性腺進行酶解,分析了多肽液的抗氧化活性,為南方刺參性腺資源高效利用提供了方法依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮刺參性腺 北方養殖刺參性腺由許鑫海參加工廠提供,養殖位置為青島市即墨區田橫鎮馬龍島,2016年9月采收,-20 ℃冷凍后運往實驗室;南方養殖刺參性腺 溫州蒼南水產技術推廣站提供,養殖地點為蒼南縣馬站鎮霞關海域,2017年2月采收分離,-20 ℃冷凍運往實驗室;Protomax復合蛋白酶(測定酶活5.23 mKat) 諾維信(中國)生物技術有限公司;超氧陰離子自由基檢測試劑盒(磺胺比色法) 北京雷根生物技術有限公司;羥自由基清除能力測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司;CuSO4·5H2O、NaOH、三氯乙酸 維生素C等 分析純,國藥集團。

DF-2集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 常州華奧儀器制造有限公司;FE20K pH計 梅特勒-托利多;ALPHA 1-2LD PLUS真空冷凍干燥機 德國CHRIST;SP-754紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 刺參性腺酶解工藝 新鮮南方養殖刺參性腺從養殖基地運往實驗室后,冷凍干燥(條件:-30 ℃預凍,主干燥-25 ℃,10 Pa,16 h;水分5%以下),超微粉碎機粉碎500目后待用。稱取一定量的凍干粉,按照一定比例加入水和蛋白酶,在一定溫度下酶解,結束后滅酶,8000×g離心30 min后,取上清液待測。

1.2.2 酶活力測定 酶活測定按照文獻[17],以酪蛋白溶液為底物,在40 ℃、pH7.2的條件下,每分鐘催化水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需的酶量定義為一個酶活力單位(U),為了方便計算，酶活力單位換算成mKat表示,公式為1 mKat=6×104U。

1.2.3 酶解液中多肽含量的測定 酶解液中多肽含量的測定參照文獻[18]進行,將Gly-Gly-Tyr-Arg標準品配制成0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8 mg/mL標準溶液,分別取標準溶液6 mL放入10 mL離心管中,加入雙縮脲試劑A 2.4 mL和雙縮脲試劑B 1.6 mL,混勻。靜置10 min,在2000 r/min離心10 min,離心后取上清液在540 nm的分光光度計下測定OD值,以肽濃度為橫坐標,以OD值為縱坐標繪制標準曲線,樣品中多肽含量通過回歸方程計算求得。

1.2.4 酶解液中多肽得率 分別應用上述方法,檢測酶解液酶解前后的多肽含量,計算多肽的得率[19]:

多肽得率(%)=(酶解后測得多肽含量-酶解前多肽含量)/總蛋白含量×100

1.2.5 酶解參數優化試驗設計

1.2.5.1 單因素實驗 酶解溫度對多肽得率的影響:酶添加量為0.5 mKat/g,底物濃度為6%,pH6.0,酶解時間3 h,考察不同酶解溫度(40、45、50、55、60、65 ℃)對多肽得率的影響;不同底物濃度對多肽得率的影響:酶添加量為0.5 mKat/g,pH6.0,酶解溫度50 ℃,酶解時間3 h,考察不同底物濃度(4%、6%、8%、10%、12%)對多肽得率的影響;不同pH對多肽得率的影響:酶添加量為0.5 mKat/g,酶解溫度50 ℃,酶解時間3 h,底物濃度6%,考察不同pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)對多肽得率的影響;不同酶解時間對多肽得率的影響:酶添加量為0.5 mKat/g,酶解溫度50 ℃,pH6.0,底物濃度6%,考察不同酶解時間(1、2、3、4、5、6、7 h)對多肽得率的影響;不同酶添加量對多肽得率的影響:pH6.0,酶解溫度50 ℃,酶解時間3 h,底物濃度6%,考察不同酶添加量(0.00、0.25、0.50、0.75、1.00 mKat/g)對多肽得率的影響。

1.2.5.2 響應面試驗 根據單因素實驗結果,酶作為催化劑,添加量應遵循節約、有效的原則,因此,多因素優化時,固定復合酶的添加量為0.5 mKat/g,響應面因素優化選擇酶解溫度(A)、底物濃度(B)、pH(C)、酶解時間(D)為影響因素,以刺參性腺多肽得率(Y)為響應值,根據Box-Behnken的中心組合實驗設計原理,采用4因素3水平的響應面分析法進行實驗設計,因素和編碼水平見表1。

表1 響應面試驗設計因素水平表Table 1 Factors and levelsTable of response surface design

1.2.6 抗氧化性實驗 按照響應面優化的最佳條件,對南、北方養殖刺參性腺酶解得到的多肽溶液(濃度分別為10、20、40、60、80、100 mg/mL)分別進行體外抗氧化性試驗。

1.2.6.1 超氧陰離子自由基清除率測定 使用清除超氧陰離子自由基測試盒(磺胺比色法),按照試劑盒說明書,試劑充分混勻,加入樣品或者對照(陰性對照使用純凈水、陽性對照使用0.1 mg/mL維生素C溶液),37 ℃顯色20 min,在530 nm處測定對照管和測定管的吸光值,分別記為A對照管和B測定管,多肽溶液清除超氧陰離子自由基能力計算公式:

超氧陰離子清除率(%)=(A對照管-B測定管)/A對照管×100

1.2.6.2 羥自由基清除能力測定 使用羥自由基測定試劑盒,根據試劑盒說明書,加入樣品或者對照(陰性對照使用純凈水、陽性對照使用0.1 mg/mL維生素C溶液),加入試劑3,混勻,37 ℃反應1 min(準確以秒表計時),立即加入顯色劑終止反應,混勻,室溫放置20 min,在波長550 nm,測定各管吸光度值。多肽溶液清除羥自由基能力計算公式:

羥自由基清除率(%)=(OD標準-OD測定)/(OD標準-OD對照)×100

1.2.6.3 鐵離子還原力測定 按照文獻[20]進行,在反應管中加入0.1 mL樣品溶液,再加入2.4 mL FRAP工作液,37 ℃水浴10 min,于593 nm處測定吸光度;配置0、100、200、400、800、1600 μmol/L的FeSO4的標準液替代樣品,繪制標準曲線,陽性對照使用0.1 mg/mL維生素C溶液,樣品抗氧化能力以FRAP值表示,通過方程求得相當于FeSO4濃度。

1.3 數據處理

2 結果與討論

2.1 四肽標準曲線

根據不同濃度Gly-Gly-Tyr-Arg在540 nm下測定的吸光值繪制標準曲線,結果見圖1。

圖1 Gly-Gly-Tyr-Arg標準曲線Fig.1 Standard curves of Gly-Gly-Tyr-Arg

由圖1可知,Gly-Gly-Tyr-Arg標準樣品的回歸方程為y=1.5466x+0.1064(R2=0.9992),在肽濃度0～1.8 mg/mL之間,線性關系良好,可用于溶液中多肽的檢測。

2.2 單因素實驗結果與分析

2.2.1 酶解溫度對多肽得率的影響 不同酶解溫度對刺參酶解提取多肽得率的影響結果見圖2。從圖2中看出,隨著溫度的升高,多肽得率先逐漸升高,這可能是由于溫度升高提升了酶的活力,同時也增加了酶解體系的擴散程度;當溫度為55 ℃時,多肽得率達到最高值為61.51%±0.99%,繼續升高溫度,多肽得率開始降低,這說明該酶的最適溫度在55 ℃左右,因此,選擇最佳的溫度為55 ℃。

圖2 酶解溫度對多肽得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the polypetide yield

2.2.2 底物濃度對多肽得率的影響 不同底物濃度對刺參性腺酶解提取多肽得率的影響如圖3所示,當底物濃度從4%升至12%時,提取率先增加后降低,在底物濃度10%時達到最高，提取率為66.41%±0.76%,這可能是由于底物濃度低時,酶與底物接觸概率小,降低了酶解速率,而在底物濃度較高時,酶解體系粘稠,流動性減弱,也降低了酶解速率[21],因此選擇底物濃度為10%。

圖3 底物濃度對多肽得率的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on the polypeptide yield

2.2.3 pH對多肽得率的影響 不同pH對刺參性腺酶解提取多肽得率的影響見圖4,酸性環境下,隨著pH的升高,多肽得率逐漸上升,中性環境多肽得率較高,堿性條件有所下降,當pH為7.0時,多肽得率達到最高值為64.20%±0.12%,這可能是因為酶解體系如果偏離了酶的最適pH,會導致酶活力減弱,使得酶解效率、多肽得率降低。因此,選擇最佳的pH為7.0。

圖4 pH對多肽得率的影響Fig.4 Effect of pH on the polypeptide yield

2.2.4 酶解時間多肽得率的影響 不同酶解時間對刺參性腺酶解提取多肽得率的影響見圖5。從圖5中可以看出,隨時間的延長,刺參性腺多肽的得率逐漸增加,在4～6 h,多肽得率為62.68%～64.15%之間,趨于平穩,超過6 h后,多肽得率開始迅速下降,這可能是酶解時間過長,海參性腺被降解成更短的肽或者游離的氨基酸造成的[22]。考慮到節約時間,提升酶解效率,選擇4 h為最優酶解時間。

圖5 酶解時間對多肽得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the polypeptide yield

2.2.5 酶添加量對多肽得率的影響 復合酶的酶添加量對刺參性腺多肽酶解提取多肽得率的影響見圖6。從圖6中可以看出,隨著酶添加量的增多,多肽得率逐漸增加,;當酶添加量為0.5 mKat/g和1.0 mKat/g時,多肽得率分別為61.78%±1.54%和62.73%±2.01%,差異不顯著(p>0.05),這種結果是由于在酶解體系中,底物濃度充足時,反應速率與酶濃度成正比;當底物不足、酶過量時,過量的酶不會加快反應速率,即酶的過量,并沒有影響到多肽得率。考慮到節約用酶和可溶性蛋白的量,確定酶用量為0.5 mKat/g。

圖6 酶添加量對多肽得率的影響Fig.6 Effect of enzyme addition on the polypeptide yield

2.3 響應面結果與分析

2.3.1 響應面設計試驗結果 根據Design-Expert軟件設計,試驗方案和結果見表2,從表2中可以看出,復合酶酶解刺參性腺多肽得率在32.07%～66.29%之間。

表2 響應面設計與結果Table 2 Results of response surface analysis

2.3.2 回歸方程與分析 利用Design Expert軟件,對表2中實驗數據進行多元回歸擬合，得到多肽得率的二次多項回歸方程:

Y(多肽得率)=66.78+1.88A+2.60B+4.89C+3.26D-0.15AB-0.68AC-0.07AD-1.04BC+1.00BD-0.89CD-2.78A2-3.39B2-8.65C2-4.30D2。

利用軟件開展模型可信度分析見表3,擬合度R2=0.9892,說明98.92%的變化是由所選變量引起的,說明該模型擬合程度良好;變異系數(C.V.)小于5%,表明可靠性高;信噪比為33.0494,遠大于4。綜上所述,本實驗模型較為理想,可以用于刺參性腺多肽最佳制備工藝的模擬估算。

表3 模型的可信度分析Table 3 The credibility analysis of the model

按照回歸模型方差分析(ANOVA)進行分析,分析結果見表4,從表中可以看出,模型F值為91.7,模型極顯著(p<0.01);一次項A、B、C、D和二次項A2、B2、C2、D2的對多肽得率影響極顯著(p<0.01),交互作用BC和BD對多肽得率影響顯著(p<0.05),其他交互項對多肽得率影響不顯著(p>0.05)。

表4 回歸方程系數及顯著性檢驗Table 4 Regression equation coefficient and significance examine

2.3.3 因素間交互作用 根據Design Expert軟件得出的回歸模型各因素之間的交互作用,從圖7中可以看出,酶解溫度和酶解時間一定時,隨著底物濃度升高,多肽得率先升高后降低,

隨著pH升高,多肽得率先升高后降低,從等高線圖可以看出,底物濃度與pH的交互作用對多肽得率影響顯著(p<0.05)。從圖8中看出,酶解溫度和pH一定時,隨著底物濃度升高,多肽得率先升高后降低,隨著提取時間延長,多肽得率先升高后降低,從等高線圖可以看出,底物濃度與酶解時間的交互作用對多肽得率影響顯著(p<0.05)。

圖8 底物濃度與酶解時間交互作用Fig.8 The interaction of substrate concentration and time

2.4 響應面結果與工藝條件驗證

以多肽得率最大值為評價指標,結合響應面曲面圖和等高線圖,應用上述方程,預測出最佳工藝條件為:酶解溫度55.89 ℃,底物濃度11.51%,pH7.11,酶解時間4.41 h,預測的多肽得率可達到68.23%。

考慮到實際應用,修正工藝條件56 ℃,底物濃度11.5%,pH7.1,酶解時間4.5 h,在此條件下試驗3次,實際測的多肽得率68.90%、68.03%和66.98%,平均值為67.97%,與理論值相差0.26%,可見該模型優化的最佳工藝條件具有可靠性。

2.5 南北刺參性腺多肽抗氧化活性比較

2.5.1 超氧陰離子自由基清除能力 利用最優工藝對南、北方養殖刺參性腺酶解得到的多肽溶液進行體外抗氧化性試驗,超氧自由基的清除能力見圖9。

圖9 南北方養殖刺參性腺多肽 對超氧自由基的清除能力測定Fig.9 Superoxide radical clearance rate of Apostichopus japonicas Gonad polypeptide from South and North China

從圖9中可以看出,隨著多肽濃度的升高,超氧陰離子自由基的清除率均不斷上升,當肽濃度為40 mg/kg時南、北方養殖刺參性腺多肽溶液超氧陰離子自由基抑制率分別為65.19%±2.83%、70.67%±2.29%,高于0.1 mg/mL的維生素C的抑制率61.25%±0.13%,表明刺參性腺多肽對超氧陰離子自由基有較強的抑制能力,隨著多肽濃度繼續增大,超氧陰離子自由基抑制率上升逐漸趨于穩定。

2.5.2 羥自由基清除能力 利用最優工藝對南、北方養殖刺參性腺酶解得到的多肽溶液進行體外抗氧化性試驗,羥自由基清除能力見圖10。

圖10 南北方養殖刺參性腺多肽 對羥自由基的清除能力測定Fig.10 Hydroxyl radical clearance rate of Apostichopus japonicas Gonad polypeptide from South and North China

從圖10中可以看出,隨著多肽濃度的升高,清除率均不斷上升,當多肽濃度為40 mg/kg時,南、北方養殖刺參性腺多肽溶液羥自由基抑制率為68.21%±2.68%、72.55%±3.09%,高于0.1 mg/mL的維生素C的抑制率64.54%±2.8 7%,表明刺參性腺多肽對羥自由基抑制能力較強,隨著濃度繼續增大,羥自由基抑制率上升逐漸趨于穩定。

2.5.3 鐵離子還原能力 利用最優工藝對南、北方養殖刺參性腺酶解得到的多肽溶液進行體外抗氧化性試驗,鐵離子還原能力(FRAP值)見圖11。

圖11 南北方養殖刺參性腺多肽的鐵離子還原能力Fig.11 Ferric ion reducing antioxidant power of Apostichopus japonicas Gonad polypeptide from South and North China

從圖11中看出,FRAP隨多肽濃度升高而增加,當肽濃度為60 mg/kg時,南、北方養殖殖刺參性腺多肽溶液的FRAP值分別達到613.49±25.59 μmol/L和 627.47±33.54 μmol/L,此時,大于0.1 mg/mL維生素C溶液的FRAP值,說明刺參性腺多肽具有良好的抗氧化性,隨著多肽濃度繼續增大,FRAP值的上升逐漸趨于穩定。

綜上所述,南、北方養殖刺參性腺多肽抗氧化性總體趨勢相同,但相同濃度條件下,北方養殖刺參性腺多肽的自由基清除率、FRAP值比南方養殖刺參的高,南、北方養殖刺參性腺多肽濃度為20、40、60、80、100 mg/mL時,對抗氧化能力超氧自由基、羥自由基清除率、FRAP值的縱向比較,經過比較均值獨立樣本T檢驗,無顯著性差異(p>0.05)。當多肽濃度為10 mg/mL時,南北刺參多肽超氧自由基清除率、羥自由基清除率差異顯著(p=0.026和p=0.039),這可能是由于南北刺參養殖生長環境影響不同,導致南北刺參體內含有的多糖或皂苷等活性成分差異[4],進而導致在低肽濃度下,肽的抗氧化性未起到主要作用。

3 結論

利用復合蛋白酶對南方養殖刺參性腺進行了酶解,以多肽得率為評價指標,經過單因素和響應面分析建立了酶解工藝模型,根據實際驗證,確定了最佳酶解溫度為56 ℃,底物濃度11.5%,酶添加量0.5 mKat/g,pH7.1,酶解時間4.5 h,此時刺參性腺多肽得率可達到67.97%±0.96%,結果可信。利用本方法對南、北方養殖刺參性腺酶解并進行抗氧化能力測定,發現刺參性腺多肽具有良好的抗氧化活性,南、北方養殖刺參性腺多肽抗氧化能力無顯著差異。