響應面法優化長裂苦苣菜 總生物堿提取工藝

潘方方,李秀梅,張海英,馬文建,*,楊培龍,*

(1.天津科技大學生物工程學院,天津 300457; 2.中國農業科學院飼料研究所,北京 100081)

長裂苦苣菜(SonchusbrachyotusDC.)系菊科苦苣菜屬一年生草本植物,又名苦曲菜、苦菜、苦苣菜、苦荬菜、苣荬菜等,它的特征是根垂直直伸,生多數須根。莖直立,有縱條紋,基部直徑達1.2 mm,上部有傘房狀花序分枝,分枝長或短或極短,全部莖枝光滑無毛,其主要分布在黑龍江、吉林、內蒙古、河北、山西、陜西和山東等地,資源豐富,是一種價廉易得、藥食兩用的植物[1]。苦苣菜屬植物的化學成分主要為萜類化合物(如倍半萜和三類)、黃酮類及黃酮苷。同時該屬植物中還存在香豆素、木脂素、揮發油、糖類、生物堿、有機酸類、氨基酸類及微量元素等[2]。藥理研究表明,長裂苦苣菜具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗心率失常、降壓和降膽固醇、保肝、清除自由基等作用[3-7]。生物堿廣泛存在于植物、動物、微生物等生物有機體內,其數量多、結構類型復雜多樣,是最重要的天然產物之一[8]。現代藥理學研究表明,天然植物中生物堿具有抗腫瘤、抗菌抗病毒、抗炎鎮痛、抗氧化、抗纖維化等作用[9-11]。因此研究長裂苦苣菜中總生物堿具有重要意義。

近幾年關于使用超聲波法的報道比較多,許多人采用此法研究了不同原料中生物堿的提取,如曼陀羅種子、桑葉、鐵莧菜等,這些研究極大地推動了生物堿提取工藝的發展[12]。但采用超聲波法提取長裂苦苣菜中的生物堿的研究目前還少見報道。因此,本試驗以長裂苦苣菜全草為材料,采用超聲波法提取生物堿,通過單因素和響應面優化提取工藝條件,以期優選出長裂苦苣菜總生物堿的適宜提取工藝,為開發和利用生物堿資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烏頭堿對照品 中國藥品生物制品檢定所;長裂苦苣菜 采自山東濱州,經中國農業科學院飼料研究所李秀梅助理研究員鑒定為SonchusbrachyotusDC.的全草;氫氧化鈉、無水硫酸鈉、鄰苯二甲酸氫鉀 西隴化工股份有限公司;溴麝香草酚藍指示液 北京索萊寶科技有限公司;甲基紅 上海金穗生物科技有限公司;氯仿和無水乙醇 北京化工廠;氨水和鹽酸 北京北化精細化學品有限責任公司;以上試劑 均為分析純。

SY-1000恒溫超聲提取機 北京弘祥隆生物技術股份有限公司;UV-3200紫外分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;ME-204電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;FE-28 pH計 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;YF114微型植物粉碎機 中國江陰市新友機械制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 烏頭堿標準曲線的繪制 準確稱取12.0 mg烏頭堿標品置于試管中,加入1 mol/L鹽酸溶液5 mL,溶解,加等量的1 mol/L氫氧化鈉溶液,移至50 mL容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,搖勻,即可得濃度為0.24 mg/mL的烏頭堿標品溶液。

準確量取烏頭堿標品溶液0、0.35、0.40、0.50、0.80、1.00 mL,分別置于分液漏斗中,各加蒸餾水3.00、2.65、2.60、2.50、2.20、2.00 mL,加溴麝香草酚藍指示液2.0 mL,鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉(pH=6)緩沖液5.0 mL,氯仿10 mL,旋渦振蕩3 min,室溫靜置1 h,分取氯仿液,并加入0.5 g無水硫酸鈉,靜置30 min,以只有蒸餾水的一份為空白,在410 nm處測其吸光值,以質量濃度(mg/mL)為橫坐標,吸光值(A)為縱坐標繪制標準曲線[13],標準曲線為y=0.3119x-0.0526,R2=0.9997。

1.2.2 原料預處理方法 長裂苦苣菜清洗后于40 ℃烘箱烘至恒重,然后用微型植物粉碎機將長裂苦苣菜粉碎,過60目的分析篩于密封袋中保存,備用。

1.2.3 長裂苦苣菜總生物堿的提取 稱取一定質量的長裂苦苣菜粗粉置于250 mL的錐形瓶中,以一定的料液比加入一定濃度的乙醇,在一定溫度和功率下,調至合適的pH,進行一定時間的超聲提取,靜置10 min,將上層提取液倒入離心管中,5000 r/min 離心10 min,將離心后的提取液置于250 mL的錐形瓶中,使用相對應的乙醇濃度定容,備用。

取0.1 mL的提取液置于1 mL比色管中,用一定濃度的乙醇定容至刻度,以相對應的乙醇濃度為空白,并在410 nm處測定提取液吸光值,根據標準曲線測長裂苦苣菜中總生物堿的提取率,提取率(%)=(樣品中總生物堿的重量/藥材重量)×100。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 料液比對長裂苦苣菜中總生物堿提取率的影響 采取1.2.3中方法提取長裂苦苣菜總生物堿,提取條件:在超聲功率 500 W,超聲溫度50 ℃,超聲時間30 min,pH為5和乙醇濃度為75%下,考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)對總生物堿提取率的影響,進而確定最佳的料液比。

1.2.4.2 超聲時間對長裂苦苣菜中總生物堿提取率的影響 采取1.2.3中方法提取長裂苦苣菜總生物堿,提取條件:在料液比為1∶30 g/mL,超聲功率500 W,超聲溫度50 ℃,pH為5和乙醇濃度為75%下,考察超聲時間(15、20、25、30、35 min)對總生物堿提取率的影響,進而確定最佳的超聲時間。

1.2.4.3 超聲溫度對長裂苦苣菜中總生物堿提取率的影響 采取1.2.3中方法提取長裂苦苣菜總生物堿,提取條件:在料液比為1∶30 g/mL,超聲時間為30 min,超聲功率500 W,pH為5和乙醇濃度為75%下,考察超聲溫度(40、45、50、55、60 ℃)對總生物堿提取率的影響,進而確定最佳的超聲溫度。

1.2.4.4 超聲功率對長裂苦苣菜中總生物堿提取率的影響 采取1.2.3中方法提取長裂苦苣菜總生物堿,提取條件:在料液比為1∶30 g/mL,超聲時間為30 min,超聲溫度為55 ℃,pH為5和乙醇濃度為75%下,考察超聲功率(400、500、600、700、800 W)對總生物堿提取率的影響,進而確定最佳的超聲功率。

1.2.4.5 pH對長裂苦苣菜中總生物堿提取率的影響 采取1.2.3中方法提取長裂苦苣菜總生物堿,提取條件:在料液比為1∶30 g/mL,超聲時間為30 min,超聲溫度為55 ℃,超聲功率為700 W和乙醇濃度為75%下,考察 pH(3、4、5、6、7)對總生物堿提取率的影響,進而確定最佳的pH。

1.2.4.6 乙醇濃度對長裂苦苣菜中總生物堿提取率的影響 采取1.2.3中方法提取長裂苦苣菜總生物堿,提取條件:在料液比為1∶30 g/mL,超聲時間為30 min,超聲溫度為55 ℃,超聲功率為700 W和pH為5下,考察乙醇濃度(55%、60%、65%、70%、75%、80%)對總生物堿提取率的影響,進而確定最佳的乙醇濃度。

1.2.5 Box-Benhken中心組合實驗設計 在單因素試驗的基礎上,利用響應面法對長裂苦苣菜中總生物堿的提取條件進行優化。根據Box-Benhken試驗設計原理[14],選取對長裂苦苣菜中總生物堿提取率有顯著影響的單因素液料比(A)、超聲溫度(B)、pH(C)和乙醇濃度(D)作為自變量設計響應面試驗,考察提取總生物堿的最佳提取條件,因素水平見表1[15]。

表1 響應面試驗因素水平設計表Table 1 Factors and their coded levels tested in response surface

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 料液比對總生物堿提取率的影響 由圖1可知,隨著溶劑量的不斷增加,總生物堿的提取率呈現先逐漸增大后降低的趨勢,提取率增加是因為溶劑與浸提物接觸充分,使溶出率增加,當料液比達到1∶30 g/mL時,總生物堿的提取率達到最大(20.44%),但隨著溶劑量繼續增加,提取率反而呈下降趨勢,這可能是當溶劑太多時,溶劑大量吸收超聲波輻射而使其不能完全作用于長裂苦苣菜，從而影響總生物堿的提取率,故選擇料液比為1∶30 g/mL。

圖1 料液比對總生物堿提取率的影響Fig.1 Effect of the ration of solid to liquid on the extraction ratio of total alkaloids

2.1.2 超聲時間對總生物堿提取的影響 由圖2可知,超聲時間小于30 min時,總生物堿提取率隨著超聲時間的增加,逐漸提高,但增加幅度不大。超聲時間為30 min時,提取率達到最大值(19.85%),當時間超出30 min后,總生物堿提取率反而降低。可能是因為超聲時間過長,部分不太穩定的生物堿發生了降解[16]。故提取過程中使用30 min即可。

圖2 超聲時間對總生物堿提取率的影響Fig.2 Effect of the ration of ultrasonic time on the extraction ratio of total alkaloids

2.1.3 超聲溫度對總生物堿提取的影響 由圖3可知,當超聲溫度在40～55 ℃時,總生物堿提取率隨著溫度的升高而增加;超過55 ℃時,總生物堿提取率反而有所降低。這是因為溫度過高,使生物堿的溶出量減少;也可能由于過高的溫度使生物堿結構發生改變,同時雜質的浸出量也增加,從而影響了提取效果[16-17],故選擇 55 ℃為較適宜的超聲溫度。

圖3 超聲溫度對總生物堿提取率的影響Fig.3 Effect of the ration of ultrasonic temperature on the extraction ratio of total alkaloids

2.1.4 超聲功率對總生物堿提取的影響 由圖4可知,當超聲功率小于700 W時,隨著超聲功率的增加,總生物堿的提取率也隨之增加,當超聲功率達到700 W時,總生物堿提取率達到最大值(20.34%),然而超過700 W后,總生物堿的提取率有所下降。這是因為對于一定頻率和一定發生面的超聲波來說,功率增大,聲強隨著增大,這就導致單位時間內超聲產生的空化效應增強,從而有利于提高總生物堿的提取率。但是太高的聲強會產生大量空化泡,通過反射聲波可能減少能量的傳遞,并且空化泡與聲強的增加呈非線性關系,這樣可能會破壞生物堿的結構,從而影響總生物堿的提取率。故提取過程中使用700 W即可。

圖4 超聲功率對總生物堿提取率的影響Fig.4 Effect of the ration of ultrasonic power on the extraction ratio of total alkaloids

2.1.5 pH對總生物堿提取的影響 由圖5可知,隨著pH的增加,總生物堿提取率呈上升趨勢,當 pH為5時,總生物堿提取率達到最大(20.21%),隨著pH的繼續增加,總生物堿提取率反而呈下降趨勢,故選取5為適宜的pH。

圖5 pH對總生物堿提取率的影響Fig.5 Effect of the ration of pH on the extraction ratio of total alkaloids

2.1.6 乙醇濃度對總生物堿提取的影響 由圖6可知,在乙醇濃度為75% 時,總生物堿提取率最高(19.76%),隨著乙醇濃度的繼續增大,總生物堿提取率反而有所降低。其原因是隨著乙醇的濃度增大,溶解在有機溶劑中的生物堿量會隨之增多,但當乙醇濃度超過一定值時,長裂苦苣菜中的其他物質也會被提取出來,這反而會降低總生物堿的提取率。因此選取總生物堿提取的乙醇濃度為75%。

圖6 乙醇濃度對總生物堿提取率的影響Fig.6 Effect of the ration of volume percentage of ethanol on the extraction ratio of total alkaloids

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計及結果 根據單因素實驗結果,由Design-Expert 8.05b統計分析軟件設計出的實驗方案及實驗結果如表2所示,建立四因素三水平中心組合實驗設計，共包括29個實驗方案,其中24個析因試驗點,5個中心試驗點,用以計算實驗誤差。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析 采用Design-Expert 8.05b統計軟件對所得數據進行回歸分析,回歸分析結果如表3所示,對各因素擬合后,得到回歸方程:Y=20.18-0.53A-0.068B+0.14C+0.47D-0.023AB-0.21AC-0.20AD-5.000×10-3BC-7.500×10-3BD-0.11CD-1.58A2-0.30B2-0.37C2-1.12D2

由表3可知,二項式擬合模型方程失擬項不顯著(p>0.05),回歸模型達到極顯著水平(p<0.01),說明該模型與實測值擬合較好,回歸模型R2=0.9902>0.9,表明該模型相關度好,可利用該模型分析最佳提取工藝條件。結果表明,液料比(A)、pH(C)、乙醇濃度(D)、液料比二次項(A2)、超聲溫度二次項(B2)、pH二次項(C2)、乙醇濃度二次項(D2)對響應值影響極顯著(p<0.01),液料比與pH交互項(AC)、液料比與乙醇濃度交互項(AD)對響應值影響顯著(p<0.05),各因素對響應值的影響順序為A>D>C>B。

表3 回歸統計分析表Table 3 Variance analysis for each term of the fitted regression equation

2.2.3 響應面及等高線分析結果 為了考察交互項對總生物堿提取率的影響,在兩個因素固定不變的情況下,對模型進行降維分析,經Design-Expert 8.0.5b軟件處理得到響應面及等高線見圖7,圖7a表明液料比和超聲溫度的交互作用對長裂苦苣菜生物堿提取率的影響不大。液料比過大導致了長裂苦苣菜生物堿的提取率下降,主要是由于長裂苦苣菜生物堿類化合物的相對極性影響的,料液比過大不能將一些極性較大的生物堿類物質溶解出來,另外溫度過高,可能會使生物堿類化合物降解。圖7b表明液料比與pH的交互作用對長裂苦苣菜生物堿提取率的影響顯著。圖7c表明液料比與乙醇濃度的交互作用對長裂苦苣菜生物堿提取率的影響顯著。乙醇濃度在一定范圍內可以使生物堿類化合物快速溶解,以便提高生物堿提取率。圖7d表明超聲溫度與pH的交互作用對長裂苦苣菜生物堿提取率的影響不大。長裂苦苣菜生物堿提取率會隨著超聲溫度和pH的增加而增加,當達到一定值時,長裂苦苣菜生物堿提取率就會下降或者變化不大。圖7e表明超聲溫度與乙醇濃度的交互作用對長裂苦苣菜生物堿提取率的影響不大。長裂苦苣菜生物堿提取率會隨著超聲溫度與乙醇濃度的增加而提高,當達到一定值時,提取效果不太明顯。圖7f表明pH與乙醇濃度的交互作用對長裂苦苣菜生物堿提取率的影響不大。長裂苦苣菜生物堿提取率會隨著乙醇濃度和pH的增加而增加,當達到一定值時,長裂苦苣菜生物堿提取率就會下降或者變化不大。

圖7 各兩因素交互作用對總生物堿提取率影響的響應面及等高線圖Fig.7 Three-dimensional response surface and contour plots showing interactive effects of hydrolysis conditions on total alkaloids

根據所得模型經響應面回歸分析,得出最佳提取條件為:料液比1∶28.06 g/mL,超聲溫度54.43 ℃,pH5.21,乙醇濃度76.08%,在此條件下總生物堿提取率可達到20.30%。根據實際條件,調整的優化條件為:料液比1∶30 g/mL,超聲時間30 min,超聲溫度55 ℃,超聲功率700 W,pH為5,乙醇濃度75%。

2.2.4 驗證實驗 取3等份長裂苦苣菜粗粉進行平行驗證實驗,驗證實驗中3組實驗的總生物堿提取率分別為19.93%,19.84%,20.32%,此3組實驗的總生物堿提取率的平均值為20.03%,與預測值相比,可得出相對誤差為1.35%。結果表明,經過響應回歸方程擬合出的理論值與實際值相吻合,證明用響應面法可以有效地優化長裂苦苣菜提取總生物堿的工藝。

3 結論

本實驗通過對影響長裂苦苣菜總生物堿提取的六個單因素:料液比、超聲時間、超聲溫度、超聲功率、pH、乙醇濃度進行了考察,利用Box-Behnken設計篩選出的四個主要影響因子:料液比、超聲溫度、pH、乙醇濃度。然后通過響應面分析法對各因素的最佳水平范圍及其交互作用進行了研究和探討,確定出最佳長裂苦苣菜提取總生物堿的條件為料液比1∶30 g/mL,超聲時間30 min,超聲溫度55 ℃,超聲功率700 W,pH為5,乙醇濃度75%,此條件下總生物堿提取率可達到20.30%。本實驗采用Box-Behnken響應面法首次對長裂苦苣菜中總生物堿的提取工藝進行了優化,為其進一步開發提供了科學、合理的理論和實驗依據。