黑曲霉電子束輻照突變菌的 遺傳毒性評價

崔敬愛,莊若巖,戴碧瑋,邵智韜,徐 巖,曹 勇,陳海燕,陳曉平,*

(1.吉林農業大學食品科學與工程學院,吉林長春 130118; 2.長春科技學院,吉林長春 130600)

黑曲霉(Aspergillusniger)是一種絲狀子囊真菌,在環境中十分常見[1-2]。在自然生長狀態下,黑曲霉分泌大量多種用途的酶降解環境中的生物聚合物從而獲得營養。電子束輻照黑曲霉突變菌生產的工業酶在淀粉加工、發酵、釀造、飲料生產動物飼料和造紙行業等領域發揮了巨大的作用。此外,黑曲霉突變菌還可以作為異源蛋白的生產宿主及生產檸檬酸和葡萄糖酸的細胞工廠,因其具有高產、高分泌、高安全性等優點，而被廣泛地應用于發酵工業中。

電子束輻照黑曲霉是通過電子加速器發射電子束射線通過高能脈沖直接作用在生物細胞內的DNA或通過間接作用使水和小分子物質輻解,進而破壞生物細胞內DNA,使DNA結構發生改變[3-4]。電子束輻照做為應用于食品中的一種新型物理冷加工技術[5],其本身有著獨特的特點。電子束誘變育種具有速度高、輻照效率高、不產生放射性殘留、單位耗能低、操作方法簡單等特點[6],可以通過電子束誘變的方法來獲得優良的突變菌株[7]。

近年來,隨著輻照技術在食品生產、加工、運輸上的廣泛應用以及電子束輻照技術作為一種新型的物理冷加工技術在食品生產、加工上的飛速發展[8],電子束輻照已在蔬菜、水果、干果、肉類等保鮮方面有廣泛的研究[9-13]。食品輻照技術是對食品純物理的加工過程[14],加工后的產品不會造成殘留和環境危害[15]。但是通過電子束輻照誘變的黑曲霉突變菌的安全性還未有明確的試驗證明,電子束誘變后黑曲霉的突變菌株作為食品發酵業的關鍵酶類[16-17]，其安全性也需要進一步的試驗證明。黑曲霉在接受電子束輻照后可能會產生一些輻解產物[18]，例如一些有毒的醛類物質[19]。為了更好確定電子束輻照后黑曲霉突變菌的安全性,應對輻照后的黑曲霉進行安全性評價。

本實驗根據《食品安全毒理學評價程序和檢驗方法》的規定[20]，在前期已經完成電子束輻照后黑曲霉突變菌的急性毒性試驗的基礎上,通過對小鼠進行Ames試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗、小鼠精子試驗對電子束輻照后黑曲霉突變菌進行遺傳毒性評價,旨在全面評價電子束輻照后黑曲霉突變菌的遺傳安全性，為電子束輻照后黑曲霉突變菌的安全使用提供了可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉(編號40099)、察氏培養基 購于CICC工業微生物菌種保藏中心;黑曲霉突變菌(編號40099) 經電子束誘變,從吉林農業大學食品科學與工程學院安全實驗室獲得;ICR小鼠(許可證號:SCXK(吉)2015-0001),50只7～12周齡的ICR小鼠,雌雄各半,50只6～8周齡的ICR雄性小鼠 遼寧長生生物技術股份有限公司;鼠傷寒沙門細菌營養缺陷型突變株TA97、TA98、TA100和TA102 經基因型和生物學性狀檢定合格,衛生部食品安全衛生監督檢驗所提供;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、甲醇、Giemsa染色素 分析純,上海試劑廠;環磷酰胺 成都市華西生化制品廠;D-葡萄糖-6磷酸鈉鹽 上海生化所;敵克松 丹東市農藥總廠;疊氮鈉 江蘇晶美生物科技有限公司;2-氨基芴、1,8-二羥基蒽醌 南京恒諾醫藥化工有限公司;桔霉素、二甲基亞砜 卡邁舒生物科技有限公司;牛血清蛋白(批號:SQ-2010A) 北京依托華茂生物科技有限公司;大鼠肝S9混合液 大鼠肝勻漿經低溫離心9000 r/min后所得上清液,復旦大學公共衛生學院。

XSP-4C生物顯微鏡 上海長方光學儀器有限公司;PH計 上海精密科學儀器廠;低溫冰箱 海信容聲冰箱有限公司;SW-CJ-IFD超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;JY501電子分析天平 上海蒲春計量儀器有限公司;HH-6電恒溫水浴鍋 北京長風儀器公司;DNP-9272電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備孢子懸浮液 用生理鹽水洗脫斜面試管孢子,180 r/min,30 ℃分散孢子,血球計數板計數,調整黑曲霉孢子濃度到106CFU/mL。

1.2.2 小鼠骨髓細胞微核試驗 將50只7～12周齡的健康ICR小鼠適應飼養7 d后,隨機分為五組,每組十只,雌雄各半。由于誘變后的黑曲霉突變菌含毒可能性極低,故本研究采用最大劑量耐受法對黑曲霉突變菌進行急性毒性試驗[21]。由于小鼠并未產生中毒死亡現象,所以將小鼠的最大耐受劑量設定為20 g/kg。根據小鼠的最高耐受劑量,將黑曲霉孢子懸浮液制備成不同濃度的高劑量組、中劑量組、低劑量組,以二倍梯度分別設計為6.700、3.350、1.675 CFU/mL。灌胃劑量為0.04 g/kg的環磷酰胺為陽性劑量組,蒸餾水為陰性劑量組。每個劑量組分兩次對小鼠經口灌胃,每次間隔24 h。在第二次灌胃6 h后通過頸椎脫臼的方法處死小鼠。取出胸骨制作骨髓涂片,干燥后用Giemsa染液染色后在顯微鏡下觀察。每組小鼠涂片在生物顯微鏡下計數1000個嗜多染紅細胞(PCE),并計數出含有微核的嗜多染紅細胞[22]。以含微核的PCE千分率計算微核率。每組小鼠涂片計數200個PCE,顯微鏡下觀察并計算出嗜多染紅細胞與成熟正染紅細胞(NCE)的比值。

1.2.3 Ames試驗 本次試驗采用常規平板滲入法,采用四株經過鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102進行小鼠細菌回復突變試驗[23]。整個實驗實行無菌操作。本次試驗設8、40、200、1000、5000 μg/皿五個試驗劑量組,同時設陰性對照組(無菌蒸餾水)、空白對照組、陽性對照組。陽性對照組分別為疊氮鈉(TA100,不加S9)、敵克松(TA97、TA98、TA102,不加S9)作為非活化系統和2-氨基芴(TA97、TA98、TA100,加S9)、1.8-二羥基蒽醌(TA102,加S9)作為活化系統。每個劑量做三個平行皿。在相同的試驗條件下,重復試驗2次,以確定實驗數據的準確性。在37 ℃電熱恒溫培養箱中培養48 h后，直接計數法計算每皿回變菌落數[24]。

1.2.4 小鼠精子畸形試驗 選用6～8周齡,體重為25～35 kg的雄性小鼠50只,適應性喂養5 d后,隨機分為五組,每組十只。試驗設計高劑量組、中劑量組、低劑量組、陰性對照組和陽性對照組五個劑量組[25]。根據小鼠對黑曲霉突變菌的最大耐受劑量計算出,高劑量組為10 g/kg 體重、中劑量組為5 g/kg 體重、低劑量組為2.5 g/kg 體重。陰性對照組(蒸餾水代替藥品),陽性對照組(用環磷酰胺代替藥品,以40 mg/kg 體重灌胃)[26]。對小鼠經口灌胃,連續5 d每天一次。在首次灌胃后的第35 d,利用頸椎脫臼的方法處死全部小鼠,取出小鼠的兩側副睪,通過制片、染色、干燥后在高倍顯微鏡下觀察其精子形態,每只小鼠觀察1000個完整的精子,計算精子畸形率[27-28]。

精子畸形率(%)=精子畸形數/觀察精子總數×100

1.3 數據處理

采用SPSS統計軟件對Ames每個劑量組的平均數和標準差進行計算。進行t檢驗和方差分析,并以LSD(least significant difference)法和Duncan-t檢驗法對各劑量組進行比較,檢驗是否存在劑量-反應關系。檢驗的顯著性水平設定為p<0.05(顯著水平)和p<0.01(極顯著水平)。

2 結果與分析

2.1 小鼠骨髓細胞微核試驗結果

小鼠骨髓細胞微核試驗結果如表1。

表1 小鼠骨髓細胞微核試驗結果Table 1 Micronucleus test results of mouse bone marrow

由表1可見,通過哺乳動物骨髓微核細胞試驗發現，雌、雄小鼠的環磷酰胺陽性對照組與蒸餾水陰性對照組的小鼠骨髓細胞微核率具有極顯著性差異(p<0.01),該結果表明環磷酰胺具有強烈的致突變效果,陽性對照組可靠,證明本次試驗具有可靠性。黑曲霉突變菌各劑量組雌、雄小鼠的骨髓細胞微核率與陰性對照組比較均無顯著性差異(p>0.05),并且隨著灌胃劑量的增加,微核率并不隨之增加,即無劑量-效應關系。此實驗結果表明，黑曲霉突變菌的小鼠骨髓細胞微核試驗結果為陰性。證明黑曲霉突變菌不能引起哺乳動物嗜多染紅細胞的微核細胞率增加,黑曲霉突變菌無致突變作用。

2.2 Ames試驗結果

黑曲霉突變菌兩次Ames試驗結果如表2、表3。

表2 黑曲霉突變菌Ames第一次試驗結果Table 2 Aspergillus niger Ames first test

表3 黑曲霉突變菌Ames第二次試驗結果Table 3 Aspergillus niger Ames second test

試驗結果表明,陽性對照組的細菌回變菌落數均超過空白對照組、陰性對照組和五個試驗劑量組的細菌回變菌落數兩倍以上。陽性對照組表現出極強的誘變性,陽性對照組可靠,證明本次試驗具有可靠性。不同劑量組的黑曲霉突變菌在加S9和不加S9的試驗條件下,回變菌落數均未超過陰性對照組和空白對照組的細菌回變菌落數兩倍，差異不顯著(p>0.05)。兩次重復試驗得出結果大致相同,即可認為黑曲霉突變菌的小鼠Ames試驗結果為陰性。在本次試驗條件下，黑曲霉突變菌對小鼠未見致突變作用。

2.3 小鼠精子畸形試驗結果

黑曲霉突變菌各劑量組的精子畸形率如表4。

表4 黑曲霉突變菌對小鼠精子畸形試驗結果(n=5)Table 4 Test results of Aspergillus niger on sperm abnormality in mice(n=5)

小鼠陽性對照組的精子畸形率與陰性對照組的精子畸形率相比較具有極顯著性差異(p<0.01)，說明小鼠對環磷酰胺敏感,陽性對照組可靠，證明本次試驗結果具有可靠性。小鼠的各個劑量組與陰性對照組的精子畸形率均在正常范圍內,通過高倍顯微鏡對小鼠的精子形態觀察,未出現雙頭、雙尾、尾折疊、胖頭等畸變類型,黑曲霉突變菌各劑量組精子畸形率與陰性對照組相比無顯著性差異(p>0.05)。所以在此試驗條件下,黑曲霉突變菌的小鼠精子畸形試驗結果為陰性[29-31]。

3 結論

本試驗研究中,通過最大耐受計量法測得黑曲霉突變菌屬于無毒級別。采用Ames試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗的方法，對誘變后的黑曲霉突變菌的遺傳毒性進行測定。結果表明，在Ames試驗中,無論是否添加S9,黑曲霉突變菌Ames試驗結果均為陰性。表明黑曲霉突變菌無致突變作用。在小鼠骨髓細胞微核試驗中,黑曲霉突變菌不能引起哺乳動物嗜多染紅細胞的微核細胞率增加，試驗結果為陰性,表明黑曲霉突變菌并無致突變作用。在小鼠精子畸形試驗中,試驗結果為陰性,表明黑曲霉突變菌并未對小鼠的精子產生致畸作用。綜上所述,在此試驗條件下,經電子束輻照處理后的黑曲霉突變菌屬無毒性,并無遺傳毒性作用。