一測多評法測定藜麥中6種酚類成分

魏麗娟,易 倩,張 曲,趙 鋼,彭鐮心,*

(1.成都大學藥學與生物工程學院,四川成都 610106; 2.成都大學農(nóng)業(yè)部雜糧加工重點實驗室,四川成都 610106)

藜麥(Chenopodiumquinoawilld)屬藜科雙子葉植物,是一種新興的世界作物。藜麥雖然原產(chǎn)于玻利維亞、智利和秘魯?shù)饶厦绹?但自上世紀末在中國西藏開始種植以來,藜麥的營養(yǎng)研究與價值挖掘在中國得到了迅速發(fā)展,從2008年便開始在中國山西大面積種植,隨后在四川、內蒙古、云南、甘肅等地種植[1]。藜麥營養(yǎng)豐富,含有約16%的蛋白質和70%的淀粉[2-4],高于水稻和玉米,和小麥相當,礦物質、纖維素、維生素等含量均高于普通的食物,含有人體所需的全部必需氨基酸,與人類生命活動的基本物質需求完美匹配;同時,藜麥還含有多酚、黃酮、多糖、皂苷等生物活性物質,具有抗氧化、抗炎、降血糖、減肥等生理活性[5-7],是聯(lián)合國糧農(nóng)組織確認的唯一一種滿足人體基本營養(yǎng)需求的單體植物,被譽為“超級谷物”[8],具有提高人群營養(yǎng)水平和預防多種疾病發(fā)生的潛在功效[9]。

酚類成分廣泛存在于各種雜糧、水果、蔬菜、茶中,具有廣泛的生理活性,能與維生素C、維生素E和胡蘿卜素等其他抗氧化物在體內一起發(fā)揮抗氧化功效,在人體飲食營養(yǎng)健康中具有重要地位[10-12]。文獻表明,藜麥中主要含有咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素等多種酚類成分[13-14],可作為藜麥質量控制指標。藜麥中的酚類成分往往具有協(xié)同作用,因此需對其含量進行全面控制,才能更好保障藜麥的品質。然而,由于對照品來源限制,目前藜麥中酚類成分的測定大多采用傳統(tǒng)的外標法或內標法控制其中的某個成分,難以保證其質量[15-18]。一測多評法通過計算待測成分間校正因子,可實現(xiàn)在只有一種對照品的情況下同時測定多種成分,已廣泛應用于中藥材質量評價中[19-22];結合超高效液相色譜的高效分離能力,可實現(xiàn)準確快速的測定藜麥中的酚類成分,為藜麥的質量評價提供新的方法。

本課題組前期研究表明,異葒草素是藜麥酚類成分中含量較高、并且保留時間居中的一種酚類成分[23-24]。有研究表明,異葒草素有抗氧化的作用,主要是通過清除DPPH自由基;同時具有抗炎的作用;除此之外,異葒草素還具有保護臟器,刺激胰島素分泌、治療糖尿病的效果;能夠使腫瘤細胞活性下降;弱化肝纖維化;抑制肝癌細胞增值;還具抗病毒[25-27]等其他多種功能。因此本實驗以5種藜麥為研究對象,選擇異葒草素作為參照,即只測定異葒草素這一個成分,通過確定它與咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、槲皮素間的內在函數(shù)關系,通過外標法和一測多評法得到5種藜麥中各酚類成分的含量值,驗證一測多評法在藜麥的多指標成分質量評價中的適用性,進而建立藜麥中酚類成分質量控制的方法,為藜麥中酚類成分的測定提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藜麥-1、隴藜1號、隴藜2號、隴藜3號、隴藜4號 農(nóng)業(yè)部雜糧加工重點實驗室(成都大學),產(chǎn)地為四川省涼山州鹽源縣,采收期為2017年8月;咖啡酸對照品(批號:16081501)、對香豆酸(批號:16061805)、阿魏酸對照品(批號:17022303)、異葒草素對照品(批號:16080404)、蘆丁對照品(批號:16031602)、槲皮素對照品(批號:16063005) 純度均大于98%,四川省維克生物科技有限公司;甲醇 色譜純,安徽天地高純溶劑有限公司;冰乙酸 色譜純,成都市科龍化工試劑廠;水 重蒸餾水;其余試劑 均為分析純。

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀(QSM四元泵、SM-FTN進樣器、CH-A柱溫箱、PDA檢測器) 沃特世上海科技有限公司;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;CP224C十萬分之一電子分析天平 上海奧豪斯儀器有限公司;H2050R高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品的制備 精密稱定對照品咖啡酸0.00970 g、對香豆酸0.01004 g、阿魏酸0.00988 g、異葒草素0.00891 g、蘆丁0.00826 g、槲皮素0.00602 g分別置于10 mL棕色容量瓶中,加甲醇溶解并定容至10 mL,制成對照品儲備液。分別取對照品儲備液適量置于10 mL棕色容量瓶,加甲醇定容至10 mL,制成含咖啡酸19.40 μg/mL、對香豆酸50.20 μg/mL、阿魏酸49.40 μg/mL、異葒草素44.55 μg/mL、蘆丁41.80 μg/mL、槲皮素60.20 μg/mL的混合標準品儲備溶液,于4 ℃保存,備用。

1.2.2 藜麥中酚類物質的提取 酚類物質的提取參考課題組前期對酚類成分的提取方法做適當調整[23],即取60 ℃烘干至恒重的藜麥粉(過60目篩),精密稱定約1.00 g,置于100 mL錐形瓶中,加70%甲醇水溶液25 mL,搖勻并稱重,60 ℃超聲處理30 min,取出冷卻至室溫,用70%甲醇水溶液補足質量,搖勻,12000 r/min離心15 min,取上清液,0.22 μm微孔濾膜過濾,取過濾液,待測。

1.2.3 酚類測定色譜條件 ACQUITYUPLC?BEHC18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)色譜柱;流動相:甲醇(A)-0.2%冰乙酸水溶液(B);梯度洗脫(洗脫程序見表1);檢測波長為247 nm;柱溫為35 ℃;流速為0.2 mL/min;進樣量1 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution sequence

1.2.4 方法學考察

1.2.4.1 線性關系考查 分別精密吸取1.2.1對照品溶液適量,置于10 mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻配成不同質量濃度的混合對照品溶液,按1.2.3色譜條件測定,每個濃度分別進樣3次,取平均值,以對照品質量濃度為橫坐標(X),峰面積積分值為縱坐標(Y),繪制咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素的標準曲線,進行線性回歸,得到各成分的回歸方程及線性范圍。

1.2.4.2 待測成分的fs/x的計算 在線性范圍內各成分的量與響應信號峰面積呈正比增減,即f=W/A,f表示校正因子,W表示成分的量,A表示儀器響應值。在對藜麥中6種酚類成分進行質量控制時,以異葒草素(s)為內參物,根據(jù)公式fs/x=fs/fx=AxCs/(AsCx)(式中,Cs、Cx分別代表內參物與待測物成分質量濃度,As、Ax分別代表內參物與待測成分的儀器響應值),計算異葒草素與咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、槲皮素之間的fs/x。再通過fs/x方法計算咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、槲皮素5種成分的量。即取1.2.1的不同質量濃度的混合對照品溶液,按1.2.3色譜條件測定,測定咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素的峰面積,以異葒草素為內標物,分別計算各待測成分與異葒草素之間的fs/x。

1.2.4.3 精密度考查 取咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素對照品適量,按1.2.1混合標準品的制備方法制備混標,按1.2.3色譜條件測定,連續(xù)進樣6次,記錄咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素的峰面積積分值,以峰面積分別計算RSD值。

1.2.4.4 重復性考查 取藜麥粉末樣品(過60目篩)6份,按1.2.2樣品溶液的制備方法制備藜麥提取液,按1.2.3色譜條件測定,記錄咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素的峰面積積分值,以峰面積分別計算RSD值。

1.2.4.5 穩(wěn)定性考查 取藜麥粉末樣品,按1.2.2樣品溶液的制備方法,制備藜麥提取液,精密吸取同一樣品溶液,分別在0、4、6、8、12、24 h進樣1 μL,按1.2.3色譜條件測定,記錄咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素的峰面積積分值,按峰面積分別計算RSD值。

1.2.4.6 保留時間的考查 取藜麥粉末樣品(過60目篩)6份,按1.2.2樣品溶液的制備方法制備樣品溶液溶液,按1.2.3色譜條件測定,記錄咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素的峰面積積分值,以峰面積分別計算RSD值。

1.2.4.7 加樣回收率考查 取已知含量藜麥樣品粉末,精密稱取樣品約1.00 g,精密稱定,共6份,分別加入咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素對照品適量,按1.2.2樣品溶液的制備方法制備藜麥提取液,按1.2.3色譜條件測定。計算咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素的平均加樣回收率和RSD值。

1.2.5 樣品測定及一測多評法的驗證 取各個品種的藜麥粉末各約1.00 g,精密稱定,按1.2.2方法制備藜麥提取液,采用外標法按1.2.3測定5種不同品種藜麥中6種成分含量。再按照建立的一測多評法對待測成分進行色譜峰的定位,以異葒草素為內標,計算其余待測成分含量,并采用SPSS軟件對兩種方法測得的數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果與分析

2.1 對照品和樣品色譜圖

預實驗對不同流動相、不同流速、不同波長、不同溫度等條件進行研究,結果表明最適檢測條件如下:甲醇(A)-0.2%冰乙酸(B)為流動相,流速為0.2 mL/min,檢測波長為247 nm,柱溫為35 ℃,色譜條件經(jīng)優(yōu)化后,咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素分離良好,出峰時間分別為4.473、5.963、6.731、7.221、9.259、14.345 min。樣品與對照品色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品溶液色譜圖(A)和樣品對照色譜圖(B)Fig.1 UPLC chromatograms of mixed standard solution(A)and control sample(B)注:1.咖啡酸;2.對香豆酸;3.阿魏酸; 4.異葒草素;5.蘆丁;6.槲皮素。

2.2 方法學考察

2.2.1 標準曲線 通過線性回歸分析,得到各成分的回歸方程式和線性范圍,如表2。結果表明,咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素分別在0.776～19.400、1.004～50.200、0.988～49.400、0.891～44.550、0.836～41.800、3.010～60.200 μg/mL范圍內線性關系良好。

表2 藜麥中6種酚類成分的標準曲線Table 2 Standard curve of six polyphenols components in quinoa

2.2.2 相對校正因子 由表3可知,各相對校正因子的RSD值分別為1.60%、1.56%、1.21%、1.17%、2.95%,均小于3%。經(jīng)分析和綜合比較影響相對校正因子的因素,取各質量濃度下獲得的相對較正因子(fs/x)的平均值,最終確定咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、槲皮素與的異葒草素的fs/x分別為1.73、0.32、1.15、0.76、0.56。

表3 5種酚類成分與異葒草素的相對校正因子Table 3 Relative correction factors of isoorientin/five polyphenols components

2.2.3 精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性與回收率 咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素的精密度、重復性、穩(wěn)定性、相對保留時間、加樣回收率的RSD值均小于2%,由此可知儀器的精密度良好,藜麥酚類成分重復性良好,在24 h內穩(wěn)定;回收率在95%～105%之間,說明該提取方法準確可靠。

表4 精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性與回收率考查結果Table 4 Investigation results of precision,stability,reproducibility and recovery

2.3 一測多評法的驗證

為了確認一測多評法的準確性,用外標法進行比較。兩種方法得到的含量值之間用Pearson相關系數(shù)進行比較,相關系數(shù)皆為1.0000,說明兩種方法得到的各物質含量的相似性極高;從一測多評法和外標法含量間的相對誤差來分析,咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、槲皮素分別為2.17%、2.79%、1.10%、0.96%、2.3%,亦在3%以內;ESM實際測定含量與本實驗所建立的QAMS計算所得含量,經(jīng)配對t檢驗結果顯示,兩種方法所得含量值無顯著性差異(p>0.05),說明本實驗建立的一測多評法具有較好的準確性和可行性,在藜麥的多指標成分質量評價中應用是可行的。

由表5可知,5個藜麥品種之間異葒草素、咖啡酸、蘆丁的含量均存在顯著性差異(p<0.05);藜麥-1、隴藜3號、隴藜4號三個品種之間的對香豆酸沒有顯著性差異(p>0.05),但是分別和其他兩個品種之間存在顯著性差異(p<0.05);隴藜3號和隴藜4號之間的阿魏酸和槲皮素沒有顯著性差異(p>0.05),但是分別和其他三個品種之間存在顯著性差異(p<0.05);5個品種中,隴藜1號含有最高的異葒草素,含量為370.61 μg/g;隴藜2號含有最高的咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸及槲皮素,含量分別為8.04、300.21、17.75、42.75 μg/g;隴藜-1含有最高的蘆丁,含量為35.56 μg/g。此結果也說明,藜麥中酚類成分含量受自身遺傳因素的影響,本結果可為藜麥的選育提供參考。

表5 藜麥中6種酚類成分一測多評法(QAMS)與標準曲線法(ESM)測定結果比較(μg/g)Table 5 Comparison of the determination results of six polyphenols components in quinoa by QAMS and standard curve method

3 結論

本實驗建立了藜麥中6種酚類成分的一測多評檢測方法,考察了重復性、穩(wěn)定性、精密度、回收率以及保留時間的重復性,結果為RSD值均小于2%,回收率在95%～105%之間,表明藜麥中6種酚類成分的分離良好、組分色譜峰峰形對稱、保留時間穩(wěn)定,儀器精密度良好,方法學考察表明本文所建立方法準確可靠。并且本實驗對5種藜麥中6種酚類成分的一測多評法計算值和外標法測定值的測定結果利用SPSS軟件進行顯著性分析,結果為一測多評法計算值與外標法測定值得到的含量值之間沒有顯著性差異(p>0.05);通過對5個藜麥品種之間6種酚類物質含量的分析,可知不同的品種之間,6種酚類物質存在差異,其中隴藜2號中含有較高的咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸及槲皮素,本結果可為藜麥的選育提供參考。本實驗建立的一測多評法可以在只有異葒草素而無其他對照品的情況下,通過QAMS實現(xiàn)藜麥中其他5種酚類成分的定量,方法準確可行,結果可靠,可用于對藜麥中的酚類成分進行定量。