超高效液相色譜-三重四極桿質譜法 快速測定煎炸過程用油中的苯并[a]芘

廖 浩

(廣西-東盟食品藥品安全檢驗檢測中心,廣西南寧 530022)

苯并[a]芘是由一個苯環和一個芘分子稠合而成的多環芳烴類化合物[1],在環境中廣泛存在,在化石能源不完全燃燒以及食品在熏制、烘烤和煎炸過程中產生,特別是發生焦糊現象時[2]。苯并[a]芘是公認的高活性強致癌有機化合物[3-4],因此,各國先后對食品中最大殘留限量作出了規定。我國GB 2762-2017《食品安全國家標準 食品中污染物限量》中規定:谷物及其制品、肉及肉制品、水產動物及其制品為5.0 μg/kg,油脂及其制品為10 μg/kg;歐盟EC Regulation 835/2011規定為2 μg/kg。目前，食品中苯并[a]芘的檢測方法主要有氣相色譜質譜聯用法(GC-MS)[5-6]、液相色譜熒光檢測器法(LC-FLD)[7-9]、液相色譜串聯質譜聯用法(LC-MS/MS)[10-11],其中GC-MS法由于靈敏度不高，且熱穩定性不好[12],使用受到了一定限制;LC-FLD法靈敏度高,重現性較好,在現行有效的國標中成為主要的檢測方法[6,9],但是也存在定性能力不強的問題;而LC-MS/MS法則能夠同時解決靈敏度與定性能力問題。在樣品前處理中,目前多采用固相萃取法[7-8]、凝膠色譜法[13-14]、分子印跡柱法[11,15]進行凈化。EMR-Lipid固相萃取柱是一種新型的脂質增強型凈化柱,選擇性強,主要吸附油脂中C5及以上的碳鏈,同時不會吸附其他弱極性的分析物,目前在苯并[a]芘的測定中沒有文獻報道。

本研究采用EMR-Lipid固相萃取柱對基質復雜的煎炸過程用油進行凈化,有效消除了基質干擾,再使用超高效液相色譜-大氣壓化學電離-三重四極桿質譜儀(UPLC-APCI-MS/MS)進行測定,以穩定同位素稀釋法定量,方法準確、快速、靈敏度高,有利于煎炸過程用油中苯并[a]芘的定性定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

煎炸過程用油 抽樣自廣西本地餐飲企業,共20批;大豆油 中國檢科院2017年ACAS-PT459苯并[a]芘能力驗證樣品;空白花生油 萊陽魯花濃香花生油有限公司;苯并[a]芘對照品 99.0%,Dr. Ehrenstorfer Gmbh;苯并[a]芘-d12對照品 97.5%,Dr. Ehrenstorfer Gmbh;乙腈 HPLC級,德國默克股份兩合公司;EMR-Lipid固相萃取柱 600 mg 6 mL,美國Agilent公司。

ExionLC TRIPLE QUAD 6500+超高效液相色譜聯用三重四極桿質譜儀 由Analyst 1.6.3軟件控制,美國AB SCIEX公司;RRHD SB-C18液相色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm) 美國Agilent公司;XS205DU電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司;S300H超聲波清洗機 德國Elma公司;KS 260搖床 德國IKA公司;Multifuge X3R冷凍離心機 美國Thermo公司;Gradient A10 Milli-Q超純水機 法國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 質譜條件的優化 采用APCI離子源分析時,樣品需要在流速大于0.5 mL/min的流動相下才能充分離子化,無法單獨采用微量進樣泵注入標準溶液進行優化。因此,需將液相色譜泵與微量進樣泵通過三通連接混合后注入離子源中。將液相色譜流速設為0.7 mL/min,流動相為90%乙腈。同時微量進樣泵以20 μL/min的流速，注入1 μg/mL的苯并[a]芘、苯并[a]芘-d12標準溶液。通過母離子掃描,可在正離子模式下見到[M+H]+峰,由于結構穩定,在加大了碰撞能量后,得到了253.1>250.1、253.1>248.1、253.1>224.1、253.1>226.2及265.2>259.3、265.2>260.3、265.2>235.1等碎片離子信息。通過優化去簇電壓、碰撞能量、入口電壓、出口電壓等參數,使得分子離子信號達到最佳。

1.2.2 液相色譜分離條件的優化 色譜柱比較了SB-AQ、Eclipse Plus C18、SB-C18(規格均為2.1 mm×100 mm,1.8 μm)。溶劑效應方面通過進樣5、10、15 μL進行比較。流動相選擇方面參考了液相色譜熒光檢測器的方法條件[9],分別采用了甲醇-水、乙腈-水作為流動相進行選擇。結合全掃描數據,對梯度洗脫條件進行了優化,使得樣品峰與雜質峰有較好的分離。流速為0.7 mL/min,流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.2.3 標準曲線溶液的配制 精密稱取苯并[a]芘對照品、苯并[a]芘-D12對照品各10 mg,苯并[a]芘轉移至25 mL容量瓶中,苯并[a]芘-D12轉移至100 mL容量瓶中,加入乙腈定容至刻度,搖勻。將上述溶液分別轉移至棕色儲液瓶中,-18 ℃避光保存,得到苯并[a]芘儲備液0.4 mg/mL,苯并[a]芘-d12內標儲備液0.1 mg/mL。以乙腈為溶劑,將苯并[a]芘儲備液逐步稀釋至200、20 ng/mL,苯并[a]芘-d12內標儲備液稀釋至1 μg/mL,分別精密吸取一定量的苯并[a]芘標準溶液至10 mL容量瓶中,同時加入1 μg/mL的內標溶液各50 μL,以80%乙腈定容至刻度,得到質量濃度為0.1、0.5、1、5、10、20 ng/mL的標準曲線溶液,內標濃度為5 ng/mL。

1.2.4 樣品前處理 精密稱取1 g煎炸過程用油,加入乙腈4、8、12 mL進行比較,每4 mL乙腈中加入1 μg/mL苯并[a]芘-d12內標溶液25 μL,超聲處理5 min,振搖提取15 min,4 ℃下4500 r/min離心10 min,分別吸取上清液4 mL加水1 mL混勻,過EMR-Lipid固相萃取柱凈化,同時取未經凈化的提取液進行比較,過0.22 μm尼龍濾膜,供LC-MS/MS檢測。

1.3 數據處理

由Analyst 1.6.3軟件采集到的數據，導入MultiQuant 3.0.2軟件中進行數據處理,采用穩定同位素稀釋法定量。以定量離子對與內標物的峰面積比值(y)對系列標準溶液質量濃度(x,ng/mL)進行回歸，得到標準曲線。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

苯并[a]芘屬于弱極性化合物,在電噴霧離子源(ESI)中難以電離,可在大氣壓光化學離子源(APPI)[16]或大氣壓化學離子源(APCI)[11]中電離。雖然APPI源靈敏度高,但是應用范圍窄,基質效應明顯[17];或是裝置復雜需要在柱后輸送甲苯等[16],一般不作為質譜儀標配的離子源,因此本文采用了標配的APCI離子源。為追究較高的靈敏度,本研究除采用了TRIPLE QUAD 6500+三重四極桿質譜儀外,在優化了1.2.3中較為常用的質譜條件的基礎上,對不常調整或采用經驗值的放電電流、噴針長度、陶瓷噴頭高度等參數均進行了反復優化,通過調整,得到了最佳的響應;這部分參數不僅與化合物相關外,還與流動相的比例、流速等相關,且相互影響。優化后的質譜參數為:大氣壓化學電離源(APCI),多反應監測正離子模式(MRM+);氣簾氣(CUR):30 psi;碰撞氣(CAD):11 psi;放電電流(NC):2;離子源溫度(TEM):550 ℃;霧化氣(GS1):40 psi;噴針長度:1 mm;陶瓷噴頭高度:7.0 mm;去簇電壓(DP):90 V;入口電壓(EP):9 V;碰撞室出口電壓(CXP):20 V;其余參數見表2。

表2 質譜參數Table 2 Mass conditions

2.2 液相色譜條件的優化

因儀器耐壓高,從提高分離效率和響應方面考慮,選用了較細長的亞二微米色譜柱。由于苯并[a]芘極性弱,主要考慮采用C18色譜柱;通過實驗,發現在SB-AQ、Eclipse Plus C18、SB-C18上均能較好分離,在SB-AQ上出峰較快,在SB-C18上響應較好,最后采用RRHD SB-C182.1 mm×100 mm,1.8 μm液相色譜柱進行分離。通過進樣5、10、15 μL,發現無明顯溶劑效應。在儀器靈敏度滿足的情況下，考慮減少儀器污染的因素,采用5 μL的進樣量。流動相選擇方面,考慮到APCI源離子化的特點,流動相中未加入酸或銨鹽,發現苯并[a]芘在乙腈中霧化效果較好,響應較甲醇略高。優化后的MRM色譜圖見圖1。

圖1 煎炸過程用油樣品中苯并[a] 芘MRM色譜圖(1 μg/kg)Fig.1 MRM chroma chromatograms of benzo[a] pyrene in a deep frying oil sample(1 μg/kg)

2.3 標準曲線及線性范圍

實驗結果表明,苯并[a]芘在0.1～20 ng/mL內均具有良好的線性關系,回歸方程為y=0.42179x+0.02229，決定系數R2=0.9997,線性關系良好。結果見圖2。

圖2 苯并[a]芘標準曲線Fig.2 Standard curve of benzo[a]pyrene

2.4 樣品前處理方法的優化

由于苯并[a]芘的極性弱,目前多用正己烷將樣品完全溶解,為后續帶來了大量的油脂干擾。為去除油脂,一般多采用凝膠色譜法、固相萃取法、分子印跡柱法進行凈化。凝膠色譜法消耗大量乙酸乙酯、正己烷等有機溶劑,前處理時間長,需通過加標實驗來進行優化。固相萃取法則主要采用弗羅里硅藻土和氧化鋁柱,其中弗羅里硅藻土小柱對大量的油脂凈化效率較低;氧化鋁則需用到22 g的大體積凈化柱,氧化鋁的活性對凈化效果影響較大,調整活性繁瑣需要一定經驗。在采用凝膠色譜或氧化鋁凈化時,需對大體積的有機溶劑進行濃縮,對溶劑與旋轉蒸發儀的痕量污染較敏感。分子印跡柱法較為穩定,絕對回收率高,基質效應不明顯。以上方法凈化后需進行濃縮及溶劑置換,操作較為繁瑣。本文選擇由乙腈作為萃取溶劑,溶劑中的油脂含量較少,同時采用脂質增強型EMR-Lipid固相萃取小柱進行凈化。EMR-Lipid在50～80%的乙腈中凈化效率高,可根據液相條件靈活調整比例,避免溶劑效應。該固相萃取小柱為自浸潤型,無傳統固相萃取小柱活化、淋洗、洗脫的過程,操作簡便。同時比QuEChERS EMR-Lipid法[18]減少了反萃取步驟。

由于本研究采用同位素內標稀釋法進行定量,通過比較苯并[a]芘-d12同位素內標的響應對萃取體積進行比較選擇,發現當采用4 mL乙腈提取時,響應較低,而采用8、12 mL乙腈提取時,差異較小,為保證檢出限,采用8 mL乙腈進行萃取。為驗證凈化效果,分別取同一份過柱前與過柱后樣品溶液對比;以及凈化后的基質提取液與溶劑分別配制標準溶液進行對比分析,結果見表3。通過對比內標峰的響應值,發現樣品過柱前的響應為過柱后的72.4%,而基質加標為溶劑標準的97.2%。說明樣品基質有較大的抑制效應,而EMR-Lipid固相萃取小柱凈化充分。為簡化前處理,本研究采用8 mL乙腈1次萃取不進行濃縮的方法,并采用苯并[a]芘-d12作為同位素內標進行定量。

表3 EMR-Lipid固相萃取小柱凈化效果Table 3 Purification effect of EMR-Lipid solid phase extraction column

2.5 檢出限與定量限

本次實驗樣品均檢出苯并[a]芘,因此分別采用了空白花生油每1 g添加1 ng的苯并[a]芘,樣品則每1 g添加1 ng的苯并[a]芘-d12內標按1.2.4進行實驗。以兩對分子離子信噪比均大于等于3時對應的樣品含量作為檢出限(LOD),信噪比均大于等于10時對應的樣品含量作為定量限(LOQ),測得兩種不同基質中檢出限均為0.2 μg/kg,定量限為0.6 μg/kg。本法靈敏度高,測定范圍廣,滿足了GB 2762-2017《食品安全國家標準 食品中污染物限量》中對苯并[a]芘的要求。

2.6 樣品的加標回收與精密度

取煎炸過程用油樣品1 g,分別添加20 ng/mL苯并[a]芘標準溶液50、250 μL,200 ng/mL苯并[a]芘標準溶液50 μL,內標溶液40 μL,混勻,避光靜置24 h,其余步驟按1.2.4節進行,結果見表4。加標回收率在94.0%～98.7%之間,相對標準偏差在2.1%～5.6%之間。

表4 不同添加水平下苯并[a]芘的回收率與精密度(n=6)Table 4 Recoveries and RSD of benzo[a]pyrene at different spiked levels(n=6)

2.7 實際樣品的測定

取20批本地不同的餐飲企業煎炸過程用油,按1.2.4測定。測得20批樣品中均檢出苯并[a]芘,含量在1.76～6.81 μg/kg之間。同時采用GB 5009.27-2016分子印跡柱凈化液相色譜熒光檢測器法對樣品進行測定,本法較國標方法偏差在-1.82%～3.46%之間。取ACAS-PT459能力驗證(Proficiency testing)樣品測試,能力驗證是利用實驗室間比對來判定實驗室和檢查機構能力的活動,也是認可機構加入和維持國際相互承認協議(MRA)的必要條件之一。結果中的Z值是實驗室測試值與所有參加比對的實驗室得到的中位值之間的偏差。結果分為:滿意、可疑、不滿意,當Z的絕對值小于等于2時,結果為滿意。測得樣品Ⅰ為11.6 μg/kg,Z值為-0.1;樣品Ⅲ為7.45 μg/kg,Z值為-0.3,結果滿意。

3 結論

本文建立了以乙腈提取,EMR-Lipid固相萃取小柱凈化作為前處理方法,并運用超高效液相色譜串聯質譜測定煎炸過程用油苯并[a]芘的方法。該方法的線性范圍為1～200 μg/kg，決定系數R2=0.9997，檢出限為0.2 μg/kg，定量限為0.6 μg/kg。平均加標回收率為94.0%～98.7%，相對標準偏差為2.1%～5.6%。20批煎炸用油樣品中，苯并[a]芘含量為1.76～6.81 μg/kg。該方法前處理簡單、基質干擾少、定性定量準確、靈敏度高，適合大樣品量的實驗室對煎炸過程用油中苯并[a]芘的檢測。