副溶血性弧菌微滴數字 PCR定量方法的建立

方佩佩,趙麗青,馬 云,王昌軍,唐 靜,李正義,賈俊濤,姜英輝

(山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心,山東青島 266002)

副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus,VP)是一種嗜鹽的革蘭氏陰性致病菌,是我國沿海地區引起食物中毒最常見的病原菌[1-2]。當食品中副溶血性弧菌達到106CFU/mL時,即能引起食物中毒,其潛伏期為2～26 h,主要癥狀有腹痛、腹瀉、嘔吐和發燒等,嚴重可能危及生命[3-4]。副溶血性弧菌具有多種表型、血清型和產毒型菌株,針對溶血素設計的探針、引物不能檢測所有致病菌株[4-7]。不耐熱溶血毒素(Thermolabilehemolysin,TLH)由H. Taniguchi[8]等發現,它不是一個毒素基因,但存在于所有副溶血性弧菌的臨床分離株和環境分離株中[6],因此本研究選取TLH基因作為靶基因進行檢測。

近些年對副溶血性弧菌的定量檢測越來越受到關注和重視,常用的檢測副溶血性弧菌的方法有常規培養法、分子檢測法和免疫檢測法等,這些方法存在檢測周期長、特異性低、不能準確定量等缺點。國標規定,自2014年7月起水產制品中副溶血性弧菌的檢測為MPN定量法[9],檢測周期為3～5 d,此法敏感性及特異性差,且耗時長[1]。免疫磁分離和環介導等溫擴增快速檢測[2]、環介導等溫擴增技術(LAMP)[10-11]、實時熒光PCR技術[12-16]、多重PCR技術等,這些技術已發展較為成熟,且操作簡便、檢測周期短,但是免疫磁珠法靈敏度及特異性較低,分子檢測法不能對副溶血性弧菌進行準確定量[2]。

微滴式數字PCR技術(Droplet digital PCR,ddPCR)是近年來發展起來的快速、精確、可實現DNA絕對定量的PCR方法[17-18]。其原理是利用微滴生成器將含有核酸分子的反應體系分散成2萬個獨立的納升級微滴,并進行擴增,最終根據陽性微滴比例及泊松分布原理，計算待測目標拷貝數。微滴式數字PCR技術從核酸提取至完成檢測，最快能在2～3 h內完成,它既解決了傳統培養法周期長的缺點,又能夠對檢測目標進行準確定量。目前,ddPCR技術已經應用于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157∶H7、沙門氏菌、陰溝腸桿菌、單核增生細胞李斯特氏菌[17，19-23]等食源性致病微生物檢測中,但在副溶血性弧菌的定量檢測中研究較少,針對現有檢測方法的不足,本研究擬采用ddPCR技術建立起副溶血性弧菌的快速準確定量方法,提高檢出率及精確度,滿足公共衛生事件快速應急處理的需要。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

試驗菌株及材料等詳見表1。

表1 試驗菌株及材料Table 1 Test strains and materials

QX200微滴式數字PCR系統 美國伯樂公司;羅氏480實時熒光定量PCR系統 羅氏公司;CF16RXII高速冷凍離心機 日本日立公司;U-3010紫外-可見分光光度計 日本日立公司;DYY-8C型電泳儀及凝膠成像分析系統 北京市六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物的設計探針 采用V.parahaemolyticus較常用的不耐熱溶血毒素基因TLH基因引物和探針[24]見表2。

表2 副溶血性弧菌特異性PCR擴增引物和探針序列Table 2 Primer and probe sequence for V. parahaemolyticusby polymerase chain reaction(PCR)

1.2.2 菌株活化 菌株取自-80 ℃冰箱,TSA-YE培養基37 ℃活化24 h,挑取單菌落在TSA-YE培養基上37 ℃過夜純培養。挑取純培養后的菌到10 mL的營養肉湯中,120 r/min搖床培養24 h。

1.2.3 菌懸液濃度的測定及DNA提取 取活化的ATCC 17802副溶血性弧菌菌懸液,生理鹽水梯度稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7,標記備用。用3M細菌總數測試紙片計數不同梯度菌懸液濃度,每個梯度3個平行。同時取各梯度菌液各3 mL,采用北京Tiangen提取試劑盒提取基因組DNA備用。本文中除特異性驗證外,皆采用ATCC 17802副溶血性弧菌進行試驗。

采用北京Tiangen提取試劑盒，提取表1中剩余16株細菌DNA,分別標記備用。

1.2.4 數字PCR試驗 反應體系:12.5 μL ddPCRTMSuperMix for Probes(no dUTP),上、下游引物各1 μL(終濃度10 pmol),探針0.5 μL(終濃度5 pmol)[25],DNA模板(60 μg/mL)2.5 μL,用雙蒸水補足總體積25 μL。分裝預混液各20 μL,至對應的微滴生成卡的sample孔位里,在微滴生成卡的oil孔位分別加入70 μL的Droplet generator oil,進行微滴生成。將生成的40 μL微滴全部轉入96孔反應板,PCR擴增。PCR反應條件:95 ℃預變性10 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火1 min,40個循環;98 ℃固化微滴10 min。最后用微滴分析儀對擴增產物進行計數分析。

1.2.5 數字PCR方法特異性驗證 將1.2.3中提取的17株菌DNA進行104倍稀釋,按照1.2.4條件進行ddPCR檢測,驗證引物、探針特異性。

1.2.6 實時熒光PCR試驗 參照行業標準《SN/T 1870-2016 出口食品中食源性致病菌檢測方法 實時熒光PCR法》[26]。

1.2.7 數字PCR方法的檢出限及靈敏度、COPY數和菌液濃度的線性關系 將提取得到的ATCC 17802副溶血性弧菌DNA，進行瓊脂糖凝膠電泳(TAE配制0.8%瓊脂糖凝膠,使用GelRed核酸染料,樣品進樣量為3 uL,電壓130 V,電泳40 min,λ DNA/Hind Ⅲ Marker,6×DNA Loading Buffer),確定DNA片段的完整性。將1.2.3提取的不同梯度副溶血性弧菌DNA,按照1.2.4和1.2.6所述方法分別進行數字PCR和熒光定量PCR,每個梯度重復3次。確定PCR檢測副溶血性弧菌的檢出限及檢測靈敏度,建立ddPCR的Copy數和菌液濃度的線性關系。

ddPCR的Copy數與對應菌懸液濃度的換算關系公式如下:

(1)

式中:C-根據ddPCR的Copy數換算得到菌懸液的濃度(CFU/mL);X-ddPCR中20 μL體系的Copy數(個/20μL);V1-DNA提取最終的定容體積(μL);V2-DNA提取的菌懸液體積(mL);V3-ddPCR反應體系中DNA模板體積(μL)。

本試驗中,DNA提取最終的定容體積V1為150 μL,DNA提取的菌懸液體積V2為3 mL,ddPCR反應體系中DNA模板體積V3為2 μL。

1.2.8 人工污染樣品檢測 無菌混勻的鱈魚肉稱取25份,每份25 g,放于無菌均質袋中,加入225 mL的BPW徹底混勻。采用人工污染的方式制備樣品,特異性驗證添加表1中的17株菌,定量檢測ATCC 17802副溶血性弧菌樣品的污染水平大約在100、101、102、103、104、105、106、107CFU/g,并進行陰性、陽性對照,按照1.2.2提取DNA,進行ddPCR檢測。

1.3 數據處理

每個試驗重復3次,應用SPSS對數據做顯著性及相關性分析,顯著性水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 數字PCR方法特異性驗證結果

提取表1中所列菌株的DNA,用1.2.1中副溶血性弧菌引物探針進行ddPCR擴增,ddPCR結果如圖1所示,三株副溶血性弧菌呈陽性微滴信號,而其他菌株及陰性對照均未出現擴增,表明1.2.1中副溶血性弧菌引物探針的特異性較強。

圖1 數字PCR方法特異性驗證結果圖Fig.1 Specific verification results diagram of ddPCR

2.2 PCR方法的檢出限及靈敏度結果

副溶血性弧菌DNA進行瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2所示,兩組副溶血性弧菌條帶單一,DNA鏈完整,在提取過程中未出現斷裂,每個菌對應一個模板和一個copy,因此通過ddPCR擴增能夠較準確計算菌濃度。

圖2 副溶血性弧菌瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis diagram of Vibrio parahemolyticus注:1和4為marker,2和3為副溶血性弧菌DNA。

副溶血性弧菌的各梯度菌懸液濃度如表3所示,其中原倍濃度為4.4×107CFU/mL。各梯度副溶血性弧菌DNA模板ddPCR檢測結果如圖3所示,對應的有效菌懸液濃度即檢出限為4.7×105～4.7×101CFU/mL,各梯度換算濃度C(根據ddPCR的Copy數換算得到菌懸液的濃度)與3M測試片所得菌懸液濃度之間無顯著性差異(p>0.05)。反應1、2中由于模板濃度過高,無陰性微滴,無法正常推測菌懸液濃度,數值無效,此情況如需確定濃度可通過稀釋菌懸液解決。本方法中,ddPCR能夠檢測到副溶血性弧菌最低檢出限為菌懸液濃度4.7×101CFU/mL,對應ddPCR拷貝數為2 copies/20 μL,推測得模板的拷貝數為5.0×101copies/mL,靈敏度為0.2 copies/20 μL,與菌懸液濃度不具有顯著性差異(p>0.05)。

表3 檢出限及靈敏度結果Table 3 Sensitivity results

圖3 ddPCR靈敏度結果圖Fig.3 Sensitivity diagram of ddPCR注:1～8分別代表菌懸液濃度為4.4×107、4.4×106、4.4×105、 4.4×104、4.4×103、4.4×102、4.4×101、4.4×100 CFU/mL。

各梯度副溶血性弧菌DNA模板熒光PCR檢測結果如圖4及表3所示。當濃度≥4.7×104CFU/mL時,對應CT值≤35,檢測結果為陽性;當濃度為4.7×103、4.7×102CFU/mL時,35

圖4 熒光定量PCR靈敏度結果圖Fig.4 Sensitivity map of qPCR注:1～8分別代表菌懸液濃度為4.4×107、4.4×106、4.4×105、 4.4×104、4.4×103、4.4×102、4.4×101、4.4×100 CFU/mL。

以副溶血性弧菌菌懸液濃度為橫坐標,以濃度C(根據ddPCR的Copy數換算得到菌懸液的濃度)為縱坐標,生成標準曲線線性關系良好,R2≥0.99,說明采用ddPCR技術進行副溶血性弧菌的定量有可行性,為進一步的實際應用提供數據支持。

圖5 ddPCR拷貝數與菌懸液濃度的線性關系Fig.5 Standard curve for copies of ddPCR and suspension concentration of Vibrio parahaemolyticus

2.3 人工污染樣品檢測

鱈魚樣品中分別添加3株副溶血性弧菌及14株其他菌進行特異性驗證,結果如圖6所示,3株陽性菌出現明顯擴增,陰性菌株無擴增,結果與2.1相一致,證明TLH基因引物探針特異性較強。鱈魚樣品中添加梯度濃度副溶血性弧菌,提取DNA進行ddPCR擴增,結果如圖7所示,與2.2直接提取菌懸液DNA進行ddPCR擴增的結果相吻合,說明采用ddPCR技術對副溶血性弧菌進行定量實際檢測具有可行性。

圖6 人工污染樣品特異性驗證結果圖Fig.6 Specific verification results diagram of artificially contaminated sample

圖7 梯度濃度人工污染樣品檢測結果圖Fig.7 Detection results diagram of gradient concentration artificially contaminated sample

3 結論與討論

按照副溶血性弧菌的國家標準檢測要求GB 4789.7-2013[27],經過前增菌、分離純化、生化鑒定和血清學鑒定,檢測周期為3～5 d,從提取DNA到ddPCR技術僅需幾個小時,成倍縮短周期,提高了檢測效率。

ddPCR分析濃度結果與3M測試片相比,ddPCR檢測結果偏高于3M紙片結果,這可能是由于，PCR技術主要針對生物因子核酸片段檢測,已經死亡的或亞死亡的副溶血性弧菌DNA可能存在并被檢測到,因此可能出現假陽性的結果[28-29]。

王忠發等[30]采用快速熒光定量PCR檢測副溶血性弧菌定量的線性范圍為2×103～2×108CFU/mL,王建昌等[31]采用基于內參的副溶血性弧菌實時熒光定量PCR，以10倍梯度稀釋的菌液經水煮法提取DNA為模板,最低檢測限為4×102CFU/mL,張蕾[2]等采用免疫磁分離和環介導等溫擴增快速檢測得檢測限為140 CFU/mL,胡興娟[13]等采用熒光定量PCR技術得最低檢測限為72 CFU/mL。另外,相興偉[10]等采用環介導等溫擴增技術(LAMP)得檢測限50 CFU/mL。

本試驗中,ddPCR檢測得到副溶血性弧菌有效基因組DNA濃度范圍為2～19440拷貝/20 μL,靈敏度為0.2 copies/20 μL,菌懸液濃度即檢出限為50～4.86×105CFU/mL,與3M測試片結果無顯著性差異(p>0.05)。與熒光定量PCR及LAMP等技術相比,ddPCR低濃度檢測限靈敏度高、能進行準確定量。本試驗中當副溶血性弧菌濃度≤4.7×103CFU/mL時,熒光PCR檢測信號較弱,需要進行反復試驗驗證結果可靠性,而本實驗中ddPCR低濃度檢測限為50 CFU/mL,操作簡單,同時ddPCR下限可以低至單拷貝,與熒光定量PCR相比不依賴標準曲線和Ct值,能夠實現真正意義上的絕對定量[32]。

以副溶血性弧菌菌懸液濃度為自變量,以對應分析得COPY數為因變量,得到標準曲線R2≥0.99,線性關系良好。以容易檢出副溶血性弧菌的鱈魚為人工污染樣品進行特異性驗證及梯度濃度副溶血性弧菌陽性添加,結果證明采用ddPCR技術進行副溶血性弧菌的定量有可行性,具有實際應用價值。

綜上,副溶血性弧菌ddPCR定量檢測技術特異性良好,副溶血性弧菌ddPCR定量結果與實際菌濃度無顯著差異(p>0.05),因此采用ddPCR技術對突發公共衛生事件應急檢測、控制疫情擴散、提高病原菌檢出率等均有重要意義[30,33]。