凍藏對面團中面筋蛋白分子結構 及功能特性影響的研究進展

鄒 敏,楊潤強,顧振新,王 沛

(南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

冷凍面團技術起源于20世紀50年代,其標準化、方便化等諸多優越性推動了烘焙行業品牌連鎖經營模式的快速發展[1],這是實現主食工業化生產的重要途徑之一。冷凍面團具有降低生產成本、提高產品質量、極大方便消費者等優點,其應用范圍非常廣泛,除可用于面包生產外,還可應用于加工生產具有中國特色的饅頭、包子和餃子等速食食品[2]。但是由冷凍面團生產出的面包、饅頭等發酵產品的醒發時間延長、體積變小、貨架期縮短的不足之處也逐漸顯現[3]。

面團品質劣變是縮短冷凍面團貨架期的主要原因。這主要是因為在冷凍期間,面團的組分(面筋蛋白、酵母、水分、淀粉)會逐漸劣變。主要有三個方面:面團中的水分在冷凍過程中凍結形成冰晶,溫度波動會導致冰晶發生重結晶,隨著冰晶體積增大破壞了面筋的網絡結構[4],面團的筋力逐步損失,面團持氣力下降[5-6];在凍藏過程中,酵母細胞內的水會形成冰晶,冰晶體積增大會造成酵母細胞損傷、破裂,使其存活率和產氣性都大大下降[7],最終導致產品體積變小、質量變差[8];冷凍會影響淀粉的老化,由冷凍面團生產的產品老化速度會加快,使產品的質構、口感等變差[9]。

諸多研究報道指出,冷凍面團品質下降的主要原因是面筋蛋白在凍藏過程中品質發生劣變。因此,研究面筋蛋白的品質在凍藏過程中發生的變化能夠完善冷凍面團品質劣變機理,同時為改善冷凍面團品質提供理論依據[1]。本文綜述了凍藏過程中面筋蛋白的分子組成、空間結構和功能特性等方面的變化。

1 小麥面筋蛋白的分類和結構

水洗去淀粉顆粒和水溶性部分后得到小麥面筋蛋白。根據洗滌的徹底性,干物質中含有75%～85%的蛋白質、5%～10%的脂質以及少量的淀粉和非碳水化合物。一般而言,面筋指的是蛋白質,其品質主要決定了面團的強度和粘彈性,對面制品食用品質起到關鍵作用[10]。面筋蛋白含有多種蛋白質成分,它們以單體存在或者通過鏈間SS鍵形成寡聚物或聚合體。其氨基酸組成中,含有大量的谷氨酰胺和脯氨酸及非極性氨基酸,帶電的氨基酸含量低。天然面筋蛋白的分子量范圍為3×104～1×107Da[11]。

Osborne[12]提出了小麥面筋蛋白的分類方法,即根據面筋蛋白在70%乙醇水溶液中的溶解度差異分為醇溶性的醇溶蛋白和醇不溶性的谷蛋白[1,13]。醇溶蛋白和谷蛋白的比例約為1∶1,兩者相互交聯形成面筋網絡結構(圖1),同時它們是面筋蛋白流變學特性和面制品品質的主要決定因素[14]。麥谷蛋白的分子量分布比較寬,它是由多肽鏈通過二硫鍵結合形成的大分子,主要賦予面筋蛋白彈性,決定面筋蛋白彈性性能的主要因素是谷蛋白分子鏈中的一些重復單元(富含脯氨酸、谷氨酸、結氨酸和賴氨酸)[15-16]。醇溶蛋白是由疏水性多肽通過分子內的二硫鍵形成的單鏈,賦予面筋蛋白粘性[17]。

圖1 面筋模型結構示意圖[18]Fig.1 Schematic diagram of gluten model structure[18]

1.1 醇溶蛋白

大多數醇溶蛋白為單體蛋白,結構緊密呈球狀(圖2),其分子內無鏈外SS鍵[19],分子量為30～80 kDa,根據其在低pH條件下電泳遷移率的不同可分為α-醇溶蛋白、β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白和ω-醇溶蛋白四種類型[20]。ω-醇溶蛋白含有大量的谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸(合計占氨基酸組成的80%)和極少量的含硫氨基酸,被稱為貧硫醇溶蛋白。相反,α-醇溶蛋白、β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白含有少量的谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸和大量的含硫氨基酸,被稱為富硫醇溶蛋白[13]。

圖2 谷蛋白和醇溶蛋白結構示意圖[18]Fig.2 Schematic diagrams of glutenin and gliadin structure[18]

醇溶蛋白有兩個不同的結構域:氮(N)端結構域和碳(C)端結構域(圖3)。其中α-、β-、γ-三種醇溶蛋白結構相近,均有重復N端區域和非重復C端區域,肽鏈上存在3～4個分子內二硫鍵[21],分子量為30～45 kDa。α-醇溶蛋白的N段和C段幾乎等長,N端結構域由兩段重復的氨基酸序列(PGGPT和PGPGPPP)組成,α-醇溶蛋白重復域主要為β-轉角結構,但β-轉角在肽鏈上分布不規則,不能形成β-螺旋,因而無彈性,在溶液中呈棍棒狀[21]。ω-醇溶蛋白結構特殊,以一個肽段單元(PGGPPPGG)為主要重復區域,該肽段單元無半胱氨酸殘基,主要通過谷氨酰胺殘基上氫鍵與其它亞基或蛋白質進行結合,其分子量較大,為65～80 kDa[22]。ω-醇溶蛋白中β-轉角雖在整個肽鏈上分布較為規則,但由于分子缺乏半胱氨酸,肽鏈間不能交聯形成彈性化合物[23]。

圖3 醇溶蛋白的一級結構示意圖[24]Fig.3 Schematic representation of primary structure of gliadin[24]

1.2 谷蛋白

谷蛋白是通過分子間二硫(SS)鍵形成的聚合體蛋白,呈纖維狀(圖2),分子量為100～1000 kDa[25]。谷蛋白在十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖譜中分為高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GS)和低分子量麥谷蛋白亞基(LMW-GS)[16,20],HMW-GS與LMW-GS所占比例是決定谷蛋白性能的主要因素,與面團強度和面包體積有著重要關系[21]。

HMW-GS可分為x-和y-兩種類型,分子量分別為80～90 kDa和65～75 kDa,一級結構一般含有630～830個氨基酸,由17～20個多肽亞基構成,分子量約為675～880 kDa[23]。其肽鏈可分為三段(圖4):非重復的N端,非重復的C端和重復的中心疏水區域[21]。其中N端含有80～105個氨基酸,C端含有42個氨基酸,兩端含有全部的半胱氨酸殘基,表現出較強親水性,這有利于二硫鍵及首尾相連線狀肽鏈分子形成,多個亞基通過二硫鍵形成纖維狀谷蛋白分子[26];中心域由富含脯氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸等重復序列的480～700個氨基酸殘基組成,不含半胱氨酸[21]。N和C末端結構域的二級結構主要是α-螺旋,而中心域的二級結構主要為β-轉角,多個β-轉角進一步形成特殊β-螺旋的超二級結構,這種結構對面團的彈性具有一定的貢獻作用[1]。

圖4 谷蛋白的一級結構示意圖[10]Fig.4 Schematic representation of primary structure of glutenin[10]

LMW-GS可分為B、C和D三種類型,大多數LMW-GS為B型,分子量為40～50 kDa,C型的分子量為30～40 kDa。由于基因編碼的重疊,B和C型LMW-GS的一、二級結構與α-和β-型醇溶蛋白較為相似,D型LMW-GS則與ω-醇溶蛋白接近[1]。LMW-GS的N末端區域中的重復單元富含谷氨酰胺和脯氨酸,如QQQPPFS[27],該區域中主要為β-轉角結構,可進一步形成規則的螺旋結構,具有剛性[28];C末端區域和α/β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白序列相似,富含α-螺旋結構,結構較為緊湊[23]。

2 面筋蛋白的分子組成在凍藏過程中變化

面筋蛋白的分子量大小及分布與面團的延伸性能和面制品的品質有關,而二硫鍵與面筋蛋白網絡結構的形成密切相關。因此,凍藏過程中面筋蛋白的分子組成變化會影響冷凍面團產品的品質。

2.1 面筋蛋白分子量的變化

面制品的品質受面筋蛋白分子量的大小及其分布的影響。例如,在面團的加工過程中,面筋蛋白分子量分布決定面團的物理性能。Southan 等[29]報導了面團拉伸強度的大小與分子量高于臨界值(1×106Da)的面筋蛋白含量呈正相關。在面包的焙烤中,Sapirstein 等[30]發現面團的延展性和面包的體積與面筋蛋白分子量的大小以及分布存在著一定的聯系。Ribotta 等[31]研究指出,在-18 ℃的凍藏條件下,分子量為 88700～129100 Da的谷蛋白亞基隨著凍藏時間的延長而明顯降低。Sharadanant 等[32]研究發現,面團在經過凍融處理后,小分子麥谷蛋白明顯增加。Zhao 等[33]發現在凍藏過程中面筋蛋白內部二硫鍵發生斷裂,高分子面筋蛋白(105～109Da)發生解聚,而分子量集中在3×105～4×108Da之間的面筋蛋白分子在反復凍融后解聚現象更為嚴重。Wang等[34-36]利用高效液相分子排阻色譜(SE-HPLC)對面筋蛋白分子量進行定量分析,發現凍藏后可溶性蛋白含量明顯增加,并進一步驗證了麥谷大分子蛋白(GMP)在凍藏過程中發生解聚造成了面筋蛋白的解聚,并且醇溶蛋白可促進GMP的解聚,直接導致面團持氣能力下降,面制品感官品質下降。

2.2 面筋蛋白游離巰基(SH)變化

二硫(SS)鍵是維持面筋蛋白結構和決定其功能特性的最重要因素之一,對面筋蛋白網絡結構的粘彈性至關重要,也與面制品的加工品質關系密切。SS鍵是由兩個游離巰基氧化形成,因此游離SH含量的變化是反映SS鍵變化的一個重要指標[37]。趙雷等[38]研究表明,在凍藏過程中,面筋蛋白發生解聚,SS鍵斷裂形成游離SH,凍藏120 d后,游離SH增加了3.1 μmol/L。造成這種結果的原因主要有兩方面,一是凍藏會導致自由水含量降低,誘發冷凍濃縮效應,使蛋白質分子內和分子間二硫鍵交換反應機率增加[39];另外則是在凍藏過程中,冰晶隨凍藏時間的延長不斷生長或發生重結晶,導致蛋白分子內外部的二硫鍵部分斷裂、分子內部的巰基暴露,進而致使游離巰基含量增加[40]。Wang 等[1]的研究也發現凍藏過程中面筋蛋白的SH含量升高,而谷蛋白的SH含量先降低后升高,醇溶蛋白的SH含量無明顯變化,這說明在凍藏過程中,面筋蛋白和谷蛋白的鏈外SS均發生斷裂,谷蛋白的鏈內SS鍵可能也受到凍藏影響,醇溶蛋白的鏈內SS鍵在凍藏過程中保持穩定。

2.3 面筋蛋白自由氨基的變化

面筋蛋白中含有一定量具有活性的蛋白水解酶,如偶氮酪蛋白酶(azocaseinase)和血紅蛋白酶(haemoglobinase)[41],這些酶會切斷面筋蛋白的肽鏈從而導致自由氨基含量增加[33]。Zhao等[38]研究發現,面筋蛋白在凍藏120 d期間,自由氨基含量幾乎沒有變化。這說明蛋白水解酶在低溫下被抑制,面筋蛋白不會發生水解,肽鏈沒有發生斷裂。

2.4 面筋蛋白亞基的變化

范鵬輝[16]對面筋蛋白進行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)發現,隨著凍藏時間的延長,麥谷蛋白和醇溶蛋白亞基的分子量大小和分布均未發生明顯變化,表明凍藏時間對亞基無明顯影響,亞基結構在凍藏過程中未遭到破壞。汪星星等[41]也發現凍融過程中面筋蛋白的各亞基無明顯變化。Wang 等[34]發現恒溫凍藏后的谷蛋白和醇溶蛋白各亞基含量基本保持不變,醇溶蛋白各亞基無共價聚集行為。

3 面筋蛋白的空間結構在凍藏過程中的變化

在凍藏過程中,由于水分的遷移及冰晶的重結晶會使面筋蛋白網絡結構[42]、二級結構、疏水性等發生變化,誘導冷凍面團品質的劣變。

3.1 面筋蛋白網絡結構的變化

潘振興等[43]通過掃描電鏡(SEM)觀察冷凍面團中面筋蛋白的結構發現,面筋蛋白以膜狀形態存在,構成網絡結構,淀粉顆粒為圓球形,被包裹在面筋膜中,支撐網絡結構。在未凍藏的面筋蛋白的顯微結構圖片中可以看到淀粉顆粒被緊密鑲嵌在面筋膜中,面筋網絡結構均勻,而面筋蛋白在凍藏后面筋膜變薄,淀粉顆粒暴露在面筋網絡結構之外,出現空洞,面筋結構嚴重破壞[43]。Esselink 等[44]觀察凍藏6周后的面團結構發現,面筋蛋白網絡結構發生明顯的斷裂,并且和淀粉顆粒分離。而這種現象的主要原因歸咎于冰的重結晶現象。馮俊敏等[45]和Gelinas 等[6]的研究也證實了以上結論,冰晶的重結晶會導致面筋蛋白結構的弱化。Kontogiorgos等[46]結合SEM和透射電子顯微鏡(TEM)觀察了面筋蛋白的網絡結構,在掃描電鏡下,低倍鏡觀察到液氮速凍的水合面筋蛋白結構是均勻的,而凍藏30 d后,面筋網絡結構被均勻且不規則的空隙包圍。在透射電子顯微鏡下觀察到,這些不規則的空隙主要被冰晶所填充。面筋蛋白網絡結構劣變由主要是因為兩個機制[46]:冰晶在毛細管內生長以及毛細管外大尺寸冰晶的持續生長。

3.2 面筋蛋白二級結構的變化

劉國琴等[47]發現面筋蛋白的二級結構主要由無規則卷曲和β-折疊組成,在凍融凍藏模式下,當凍藏時間達到60 d時,面筋蛋白的二級結構變化顯著;而在恒溫凍藏模式下,凍藏時間達到90 d時,其二級結構才發生變化。Wang 等[48]研究了凍藏60 d期間面筋蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白二級結構的變化,發現三種蛋白的二級結構均有α-螺旋、反向平行β-折疊、分子間β-折疊、β-折疊和β-轉角五種類型。反向平行β-折疊、α-螺旋和β-轉角結構對凍藏較為敏感,在凍藏后三種蛋白的α-螺旋結構含量均減小;反向平行β-折疊和β-轉角結構的含量增大,這說明α-螺旋結構受凍藏影響部分轉變為了后兩種結構。這種變化主要是由于凍藏導致面筋蛋白中水合環境發生改變,自由水的減少、冰晶生長產生的機械力等使維持α-螺旋的氫鍵斷裂、螺旋結構被破壞[40],蛋白分子發生重排以達到能量最低來保持相對穩定狀態。Meziani等[49]發現面團凍藏的前四周,β-折疊的含量稍有增加,β-轉角結構的含量基本不變。Georget和Belton等[50]提出β-折疊含量的增加可能是因為新的β-折疊結構的形成和一些氫鍵較弱的結構的轉變。

3.3 面筋蛋白疏水性的變化

疏水相互作用是維持蛋白質結構的主要作用力之一,它對蛋白質結構的穩定和蛋白質的功能特性具有重要作用[51]。Wang等[48]研究發現,凍藏后面筋蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白的分子構象發生重排,分子表面的疏水位點暴露增加,從而導致蛋白水合能力下降,凍藏是通過誘發醇溶蛋白和谷蛋白疏水位點的暴露來使面筋蛋白疏水性增加。劉國琴等[52]研究發現面筋蛋白的表面疏水性隨著溫度波動次數、凍藏時間和凍藏循環次數的增加而增加,推測是在凍藏過程中冰晶不斷生長,大冰晶破壞面筋蛋白的結構,進而導致面筋蛋白的結構發生改變,面筋蛋白表面暴露的疏水基團增多,其表面疏水性增強。范鵬輝等[16]研究發現,在凍藏60 d的過程中,面筋蛋白的表面疏水指數隨著凍藏時間的延長而逐漸下降。這可能是由于面筋蛋白分子部分發生聚集,致使面筋蛋白表面的疏水基團被掩埋,表面疏水性降低[53]。

4 面筋蛋白的功能特性在凍藏過程中的變化

4.1 面筋蛋白起泡性的變化

起泡性是小麥面筋蛋白的一個重要的功能特性,直接影響面團在醒發和初期烘烤過程中氣泡的分布。分布均勻、穩定的氣泡不僅可使發酵面制品的質地松軟和潤滑,還可提高風味物質的分散性,使面制品的口感變得更佳。蛋白質的起泡性取決于蛋白質的分子組成和結構特征,同時受外界環境的影響,如溫度、pH、鹽濃度、壓力等[54]。面筋蛋白冷凍后,蛋白分子的結構伸展松散,有些側鏈基團,如羥基、酚基、羧基暴露出來,蛋白質活性中心的各個基團相互分散,氫鍵、疏水作用力等次級鍵被破壞,蛋白質空間構型可能發生解體,球狀蛋白質失去了天然蛋白質的結晶能力,水化膜被破壞,面筋蛋白的起泡性隨冷凍時間的增加不斷降低[55]。Wang等[56]研究發現,凍藏45 d后,醇溶蛋白的起泡體積降低了26.18%,起泡性能發生劣變。這表明面筋蛋白的起泡性主要由醇溶蛋白決定。

4.2 面筋蛋白流變特性的變化

面筋蛋白對面團流變學性能起主要貢獻,同時影響著最終產品的食用品質。通常,醇溶蛋白賦予面筋延展性和粘性,而谷蛋白賦予其強度和彈性[17]。Jia等[57]研究了面筋蛋白的流變學性能在凍藏前后的變化。發現與新鮮面筋蛋白相比,凍藏后面筋蛋白的粘性模量(G″)、彈性模量(G′)及損耗角(tanδ)均顯著性下降,并且凍藏時間越長,其粘彈性越低。Xuan[58]和Ribotta[59]等的研究也得到相似的結果。Wang等[34]研究發現,凍藏后面筋蛋白和谷蛋白的粘彈性下降,醇溶蛋白的粘彈性無明顯變化,其指出谷蛋白流變參數降低可能是造成面筋蛋白粘彈性的損失的主要原因。諸多研究表明,面筋蛋白粘彈性的退化主要是由冰晶對面筋蛋白網絡結構造成的機械損傷、谷蛋白聚集體的解聚以及面筋蛋白二級結構的變化共同作用所致。

4.3 面筋蛋白熱特性的變化

面筋蛋白的熱特性主要反映面筋蛋白的結構在加熱過程中的變化。熱變性過程可看成是溫度的動態函數,蛋白質吸收熱量后,分子內的次級鍵被破壞,多肽鏈被打開,蛋白分子從原來的有序狀態變為無序狀態[60]。Xuan等[58]研究了凍藏60 d的面筋蛋白的熱穩定性變化,發現天然面筋蛋白的變性溫度(Tp)為52.95 ℃,凍藏60 d后,變性溫度增至60.35 ℃。Wang等[48]的研究也有相似的結果。這說明經過凍藏后面筋蛋白的低溫熱穩定性提高。有研究報道,疏水相互作用是影響蛋白質的熱穩定性的重要因素,蛋白質的熱變性溫度會隨著疏水性的增加而增加,并且蛋白質的熱變性溫度也會因聚合交聯程度的加劇而提高[61]。

5 總結與展望

目前,凍藏對面筋蛋白的分子組成、空間結構和功能特性等的影響研究較為深入,完善了冷凍面團在凍藏階段的劣變機理。面筋蛋白的品質劣變雖源于凍藏,且經凍藏的面筋蛋白品質不穩定,但在熟制階段其品質的可調性依然很強。這是因為在熟制階段,面筋蛋白的分子鏈先展開,其中的氫鍵、離子鍵等非共價相互作用被破壞,面筋蛋白結構變得松散,隨后谷蛋白與谷蛋白發生聚集,再與醇溶蛋白發生聚集形成穩定的面筋蛋白網絡結構,這對最終產品體積及質構的定型起主導作用[62]。已有的研究雖然闡明了凍藏階段面筋蛋白的品質劣變機制,但對熟制階段凍藏面筋蛋白在熱聚集作用下的品質變化缺乏系統和深入研究。因此,今后需系統研究凍藏面筋蛋白的結構和功能特性在加熱過程中的動態變化,進而從整個加工過程完善面筋蛋白劣變機制,并為有效調控冷凍面團品質提供理論依據。