硼替佐米促進霍奇金淋巴瘤細胞系L428的凋亡

陳宛麗，關紅梅，王 舒

(南陽市第二人民醫院 血液科, 河南 南陽 473000)

霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma, HL)為淋巴系統的惡性實體瘤之一[1]，其特征是瘤組織內含有特異性的R-S(Reed-Sternberg)細胞，并常伴有多量炎性細胞反應[2]。盡管部分霍奇金淋巴瘤治愈率高，但仍存在一些難治性患者，需要使用其他藥物來治療這些患者。

硼替佐米(Bortezomib)是哺乳動物細胞中26S蛋白酶體可逆抑制劑，主要用于多發性骨髓瘤的治療[3]，也用于非霍奇金淋巴瘤的治療[4]，但是用于霍奇金淋巴瘤的治療報道較少。本研究通過探究不同劑量硼替佐米對細胞系L428形態、細胞凋亡的影響，并探討可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑

經典型霍奇金淋巴瘤細胞系L428(武漢普諾賽細胞庫)；硼替佐米(西安楊森制藥有限公司)；MTT細胞活力試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒、Hoechst33258試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒(江蘇碧云天生物有限公司)；Bax、Bcl-2、cleaved casepase-3、β-actin抗體(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組及處理：將霍奇金淋巴瘤細胞系L428培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。將細胞分為對照組(control)和不同濃度硼替佐米組(分別給予10、30和50 nmol/L硼替佐米處理24 h)。

1.2.2 MTT檢測細胞活力：將L428細胞以5×103個/mL鋪于96孔板上，用硼替佐米處理后，按照說明書進行MTT實驗，并在酶標儀540 nm處讀取各孔的吸光值(A)。

1.2.3 倒置顯微鏡下觀察細胞形態：將L428細胞以5×103個/mL鋪于96孔板上，用10 nmol/L硼替佐米處理24 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

1.2.4 Hoechst33258染核：將L428細胞5×103個/mL鋪于在96孔板中，用硼替佐米處理后，按照說明書進行Hoechst33258染核操作，熒光顯微鏡下檢測，檢測條件激發光波長為380 nm，發射波長為420 nm。

1.2.5 一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡：將L428細胞5×103個/mL鋪于在96孔板中，用硼替佐米處理后，按照說明書進行TUNEL染色操作，并在熒光酶標儀激發波長450 nm和發射波長565 nm處讀取各孔的熒光值，并根據說明書計算TUNEL陽性細胞數。

1.2.6 Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測細胞凋亡：將L428細胞以5×105個/mL接種于24孔板中，用硼替佐米處理后，收集細胞；按照說明書進行Annexin V-FITC/PI進行染色操作，進行流式細胞儀上機檢測，檢測條件激發光波長為488 nm，發射波長為530 nm。

1.2.7 Western blot檢測蛋白水平：冰上萃取蛋白，調整蛋白濃度進行SDS-PAGE電泳。電轉至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉40 min，室溫孵育一抗Bax、Bcl-2和cleaved casepase-3(1∶2 000稀釋) 2 h，洗膜3次，室溫孵育相應二抗(1∶2 000稀釋) 1 h，洗膜3次。自動顯影儀顯影，并采用Image J分析條帶吸光值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 硼替佐米對L428細胞形態學的影響

與對照組相比，加入10 nmol/L硼替佐米培養24 h后，L428細胞出現拉絲、稀疏現象(圖1A)；硼替佐米處理后的細胞核出現不同程度的固縮，出現凋亡的熒光小體(圖1B)。

2.2 硼替佐米對L428細胞活力的影響

與對照組相比，硼替佐米濃度依賴性抑制L428細胞活力(P<0.05)(圖2)。

2.3 硼替佐米對L428細胞凋亡的影響

與對照組相比，硼替佐米濃度依賴性促進L428細胞凋亡(P<0.05)(圖3)。

2.4 硼替佐米對L428細胞cleaved caspase-3蛋白表達的影響

加入硼替佐米培養L428細胞后，cleaved caspase-3蛋白水平呈濃度依賴性上調(P<0.05)(圖4)。

A.L428 cell morphology of inverted microscope; B.Nuclear morphology of Hoechst33258 staining圖1 硼替佐米對L428細胞形態學的影響Fig 1 Effect of Bortezomib on L428 cell morphology

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with 10 nmol/L; △P<0.05 compared with 30 nmol/L圖2 硼替佐米濃度依賴性抑制L428細胞活力Fig 2 Bortezomib inhibited L428 cell viability in a dose-

2.5 硼替佐米對L428細胞Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

加入硼替佐米培養L428細胞后，Bcl-2蛋白水平呈濃度依賴性下調(P<0.05)；Bax蛋白水平呈濃度依賴性上調(P<0.05)(圖5)。

3 討論

大部分霍奇金淋巴瘤患者通過常規化療可以治愈，但仍存在一些復發性患者或者難治性患者[5]，需要使用其他藥物來治療這些患者。文獻報道硼替佐米能通過激活線粒體凋亡途徑誘導多發性骨髓瘤細胞凋亡[6]，近來同樣發現能誘導非霍奇金淋巴瘤細胞凋亡[7]，但在霍奇金淋巴瘤的治療報道較少。因此，開發其他藥物對霍奇金淋巴瘤治療具有重大意義。在本實驗中，首先用MTT實驗發現，硼替佐米能濃度依賴性抑制L428細胞活力，進一步采用Annexin V-FITC/PI染色和TUNEL染色，發現硼替佐米能濃度依賴性誘導L428細胞凋亡。同時Hoechst 33258熒光染色，發現硼替佐米誘導L428細胞凋亡同時出現了細胞核固縮和凋亡小體形成。

細胞凋亡是細胞程序性死亡的過程，其中Bcl-2家族在細胞凋亡中起到重大作用[8]。Bcl-2家族由抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w等)和促凋亡蛋白(Bax、Bit、Bim等)組成[9]。在凋亡過程中，Bcl-2降解，胞質Bax轉位至線粒體膜，增加通透性，釋放細胞色素C，最終激活caspase-3誘導細胞凋亡[10-12]。因此，本研究采用Western blot觀察了硼替佐米對L428細胞Bcl-2和bax的影響，發現Bcl-2表達下調，Bax上調，且檢測到caspase-3的切割片段，故結合以上結果及文獻分析，提示硼替佐米可能通過下調Bcl-2蛋白的表達，促進Bax轉位，從而引起線粒體外膜通透性增加，caspase-3激活，最終導致細胞凋亡。

A.representative images and statistical analysis of Annexin V-FITC/PI staining; B.statistical analysis of TUNEL staining;*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with 10 nmol/L;△P<0.05 compared with 30 nmol/L

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with 10 nmol/L;△P<0.05 compared with 30 nmol/L

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with 10 nmol/L; △P<0.05 compared with 30 nmol/L圖5 Western blot檢測硼替佐米對細胞Bcl-2和Bax蛋白表達的影響Fig 5 Effect of Bortezomib on the protein expressions of Bcl-2 and Bax detected by Western