高遷移率族蛋白1促進原發性肝癌細胞增殖

蔡惠美，曹文瑜*，黃玉鈿，傅建英，馬燕燕

(福建醫科大學附屬福州市第一醫院 1.消化內科; 2.病理科, 福建 福州 350000)

侵襲和轉移是威脅腫瘤患者生命的主要因素，也是惡性腫瘤的基本生物學特征[1-3]。高遷移率蛋白B1(high-mobility group box-1 protein, HMGB1)是一種腫瘤轉移促進蛋白，存在于多種生物體內，在人體內廣泛分布于淋巴組織、肝、腦、肺、心和腎等組織中，在進化中高度保守[4]，其表達和腫瘤的侵襲與轉移有密切的關系[5-6]。晚期糖基化終產物受體(receptor for advanced glycation end product, RAGE)是細胞表面分子中免疫球蛋白超家族的成員之一，RAGE參與多種腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移[7-8]。而RAGE是HMGB1的唯一受體。關于HMGB1和RAGE蛋白在原發性肝細胞癌中的表達情況國內外報道較少。

本研究旨在探討肝癌組織及細胞中HMGB1及RAGE的表達，研究HMGB1抑制肝癌細胞凋亡的可能作用途徑，分析肝癌的可能致病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 組織樣本及細胞：選擇2012 年1月至2016 年6月福建醫科大學附屬福州市第一醫院消化科收治的25例原發性肝癌患者作為研究對象，25例患者中男20例，女5例，年齡38～76歲，平均(52.5±11.6)歲。瘤體≤5 cm者15例，瘤體>5 cm者10例。以距癌灶邊緣5 cm為界分別留取癌灶組織和非癌組織。所有標本均經病理組織學證實為原發性肝細胞肝癌。該研究已獲得單位倫理委員會的審查批準書及受試者簽署的知情同意書。HepG2細胞系(中科院上海細胞研究所)。

1.1.2 試劑及試劑盒：鼠單克隆抗體HMGB1(ab11354)和RAGE(ab54741)(Abcam公司)。S-P免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；胎牛血清、鏈霉素和青霉素、DMEM和RPMI1640高糖培養基(Gibco公司)；重組人HMGB1蛋白(Active Motif公司)；MTT試劑盒(碧云天生物公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組織化學法HMGB1和RAGE表達：肝癌及癌旁組織免疫組化以經典的S-P 法進行。HMGB1工作濃度1∶100，RAGE工作濃度1∶200，每片滴加HMGB1一抗，4 ℃冰箱過夜；DAB顯色。以PBS液代替一抗作為陰性對照；用已證實的HMGB1染色陽性肝癌標本作為陽性對照。

1.2.2 HepG2和L02細胞系的培養：HepG2和L02細胞系分別采用含有10%胎牛血清及鏈霉素(100 U/mL)、青霉素(100 U/mL)的DMEM和RPMI1640高糖培養基，于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中進行培養。

1.2.3 HepG2和L02細胞系中HMGB1及RAGE表達的檢測：將HepG2和L02細胞系按1.5×106個/mL密度接種到60 mm培養皿中進行培養，待細胞貼壁之后提取細胞總蛋白。采用Western blot檢測兩株細胞中HMGB1及RAGE的表達情況，以β-actin為內參。用Quantity One軟件進行光密度分析。

1.2.4 rhHMGB1對HepG2細胞增殖能力的檢測：將HepG2細胞按1.0×104個/孔密度接種到96孔板中進行培養，分別采用不同濃度重組人HMGB1蛋白(recombinant human HMGB1 protein，rhHMGB1)(0、10、50和100 μg/L)處理細胞24 h以及50 μg/L的rhHMGB1處理不同時間(0、12、24和36 h)。采用MTT試劑盒測定HepG2細胞增殖能力，自動酶標儀490 nm處檢測吸光度(A)值。其中每組設置6個復孔，實驗重復3次。

1.2.5 rhHMGB1對HepG2細胞RAGE和NF-κB表達影響的檢測：將對數增殖期HepG2細胞按1×105個/孔接種到6孔板中進行培養，分別采用不同濃度rhHMGB1(0、10、50和100 μg/L)處理細胞24 h以及50 μg/L的rhHMGB1處理不同時間(0、12、24和36 h)，每組設置兩個復孔。處理結束后提取細胞總蛋白，采用Western blot檢測不同處理組細胞RAGE和NF-κB的表達水平，以β-actin為內參。用Quantity One軟件進行光密度分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 HMGB1和RAGE在肝癌組織和癌旁組織中的表達

HMGB1和RAGE蛋白在肝癌組織的陽性表達率(蛋白表達樣本數/總樣本數)為64%和72%，分別顯著高于癌旁組織的20%和28%(P<0.05)(表1，圖1)。

2.2 HepG2和L02細胞中HMGB1及RAGE的表達

HepG2細胞中HMGB1及RAGE的表達量均明顯高于L02細胞(圖2)。

2.3 rhHMGB1對HepG2細胞增殖能力的影響

隨著rhHMGB1濃度的升高及處理時間的延長，HepG2細胞的增殖率顯著增強(圖3)。

2.4 HepG2細胞經rhHMGB1處理后RAGE和NF-κB的表達

隨著rhHMGB1濃度的升高及處理時間的延長，細胞中NF-κB和RAGE的表達顯著上調(圖4)。

表1 HMGB1和RAGE在肝癌組織及正常 肝組織中的表達

*P<0.05 compared with normal liver tissues.

3 討論

HMGB1除了在多種炎性反應中起重要調控作用外，在乳腺癌、前列腺癌和胃癌等腫瘤的侵襲轉移中起到了關鍵性的調控作用，通過其主要受體RAGE和Toll樣受體對下游一系列抑癌或促癌因子的作用，影響腫瘤的發生發展[9-11]。而在肝臟相關腫瘤中，HMGB1的研究尚處于起步階段。現有的大部分研究僅從臨床病例及組織中得到HMGB1與肝癌的相關性，而從細胞及動物模型上對HMGB1和RAGE在肝癌的發生發展過程中所起作用和相關機制尚缺乏深入研究。

A.HMGB1 expression in tumor tissues; B.HMGB1 expression in normal tissues; C.RAGE expression in tumor tissues; D.RAGE expression in normal tissues

圖1腫瘤與正常組織S-P免疫組化結果
Fig1S-Pimmunohistochemistryresultsoftumorandnormaltissues

*P<0.05 compared with control group

*P<0.05 compared with control group

本研究采用免疫組化的方法對肝癌組織和癌旁組織中HMGB1及RAGE的表達進行了觀察。結果表明，肝癌組織中HMGB1的表達陽性率遠高于癌旁組織中。同時肝癌組織中RAGE的表達率也明顯高于癌旁組織。上述結果表明，HMGB1和RAGE在肝癌組織中呈現高表達的趨勢。對肝癌細胞系HepG2和普通正常肝臟細胞系L02中HMGB1和RAGE表達水平的檢測結果表明，在正常培養條件下，HepG2細胞中HMGB1和RAGE蛋白水平明顯高于L02細胞。這也與肝癌組織中HMGB1和RAGE高表達結果相一致。因此推斷HMGB1和RGAE對于肝癌的發生發展存在重要相關性。此外，向HepG2肝癌細胞系中加入rhHMGB1，采用MTT法檢測處于不同濃度rhHMGB1以及不同處理時間作用下HepG2細胞的增殖率，結果表明，隨著rhHMGB1濃度的升高及處理時間的延長，HepG2細胞的增殖率顯著增強。同時，細胞中RAGE和NF-κB蛋白的表達顯著上調。這提示HMGB1能刺激HepG2肝癌細胞的增殖，HMGB1可能通過與其受體RAGE結合, 進一步激活NF-κB信號通路, 從而促進肝癌細胞增殖。這也提示HMGB1-RAGE軸可能成為肝癌治療的潛在靶點。

總之，HMGB1-RAGE軸可能參與了人類肝癌的發生、發展及增殖機制，隨著對HMGB1-RAGE軸研究的深入，其可能成為肝癌治療的潛在靶點。