離體黑果枸杞再生途徑的研究

曹君邁,馬海軍,譚亞萍

(北方民族大學生物科學與工程學院,寧夏 銀川 750021)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr)是我國荒漠地區特有的一種野生植物[1]，是西北地區一種重要的中藥材，在藏藥中廣泛應用[2]。我國對紅果枸杞的研究始于19世紀初期，而對野生黑果枸杞的研究卻晚了一個世紀。有關黑果枸杞的生理生態[3-4]、各種抗性[5-6]、營養成分分析和提取[7]、藥性及藥理學作用[8]、抗旱價值[9]以及開發利用前景[10]等方面已有大量文獻報道。正是基于學者的研究結果認為黑果枸杞的保健及藥用價值遠高于普通紅枸杞[11]，這樣導致市場對黑果枸杞的需求量劇增，同時以黑果枸杞為主要原料的藥品、茶品、保健品等系列產品的開發，從而推動了黑果枸杞產業的迅速發展。面對多元化市場的需求，以及野生資源有限的局面，利用常規栽培方法已不能滿足枸杞產業的快速發展，且常規栽培方法植株繁殖速度慢[12]，采用組織培養技術手段可有效提高種苗繁殖速度、緩解對野生資源破壞性的采挖。然而，關于黑果枸杞組織培養研究報道的文獻較少[13-15]，缺乏系統的、深入的研究，同時還存在生產成本高，繁殖系數低[14]，不同品種之間配方差異很大等問題，給標準化的工廠化生產帶來了一定難度。本研究試圖以愈傷組織誘導、叢生芽誘導及葉片直接誘導小植株的再生途徑為研究目的，以期探討出黑果枸杞最佳的離體繁殖途徑，建立高效的無性繁殖技術體系，為野生黑果枸杞資源的充分保護和利用以及規模化生產提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

黑果枸杞金塔種子來自甘肅農業大學。以MS培養基作為基本培養基。

1.2 方 法

1.2.1 實驗設計 實驗于2015年3月-2016年4月，在北方民族大學生科院組培實驗室進行。采用單因素隨機區組設計，以激素為處理因素，將各種外植體接種于不同處理的培養基上，每個處理接種15瓶，剔除污染瓶后，每種處理統計10瓶，以葉、莖段、愈傷組織做外植體時，每瓶接種5個，其余材料做外植體時，每瓶接種3個。

1.2.2 無菌苗的獲得

(1)種子的消毒。挑選150粒形狀大小、飽滿度一致的黑果枸杞種子，用蒸餾水泡后放入4℃冰箱備用。第二天取出放入已開啟滅菌的超凈工作臺上，將種子放入裝有70%乙醇的無菌培養皿中消毒5s左右，用無菌蒸餾水反復洗滌3次，再用2%的次氯酸鈉溶液將種子浸泡消毒25 min，繼續用無菌蒸餾水洗滌3次，洗去殘余溶液，洗滌后放在滅菌濾紙上，吸干種子表面的水分。

(2)接種。將消毒后晾干的種子接入MS培養基上，每瓶培養基接15粒黑果枸杞種子，一共10瓶，編號后送入培養間進行培養。

(3)培養條件。固體培養基：白砂糖20 g·L-1，瓊脂5 g·L-1，MS營養成分，pH值調至5.8～6.0；培養室溫度25 ℃左右；光/暗周期15 h/9 h，光強2 000 Lx左右。

1.2.3 愈傷組織的獲得 待黑果枸杞的無菌苗長到6 cm左右時，以葉片和莖段為外植體，要求規格如下：葉片為0.5～1 cm2，莖段要截取成帶3片葉且高度為2 cm大小，接種到激素配比不同的7種培養基上，即：1. 2,4-D 0.1 mg·L-1、2. 2,4-D 0.2 mg·L-1、3. 2,4-D 0.3 mg·L-1、4. 2,4-D 0.4 mg·L-1、5.0 mg·L-1(無激素)、6. IBA 0.2 mg·L-1、7. NAA 0.2 mg·L-1。

1.2.4 叢生芽的獲得 取長勢一致且旺盛的愈傷組織，將其分割成大小約1 cm3的團塊，分別接種到激素配比不同的4種培養基，即：8. 6-BA 0.5 mg·L-1、9. 6-BA 0.5 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1、10. 6-BA 0.5 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1、11. 6-BA 0.5 mg·L-1+KT 1.5 mg·L-1。

將按規格要求剪切的莖段分別接種到激素配比不同的5種培養基，即：12. 6-BA 0.2 mg·L-1、13.6-BA 0.2 mg·L-1+IBA 0.01 mg·L-1、14. 6-BA 0.2 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1、15. 6-BA 0.2 mg·L-1+NAA 0.01 mg·L-1、16. 0 mg·L-1(無激素)。

1.2.5 葉片誘導再生植株 取無菌苗葉片剪切成0.5～1 cm2，每片葉剪傷2處，分別接種于激素配比的5種培養基，即：17. 6-BA 0.01 mg·L-1+2,4D 0.01 mg·L-1、18. 2,4D 0.01 mg·L-1、19. IBA 0.01 mg·L-1、20. NAA 0.01 mg·L-1。

1.2.6 再生植株的獲得 莖段或愈傷組織誘導的叢生芽，待芽長至3 cm高時，轉入MS培養基形成再生植株。

1.2.7 數據的調查統計

(1)待種子萌發后一個星期內統計枸杞發芽率和污染率。

種子萌發率=發芽種子數/接種種子總數×100%

污染率=污染的瓶數/總瓶數×100%

(2)觀察記錄愈傷組織的生長情況，統計黑果枸杞外植體的愈傷量、出愈率和生長狀況。

出愈率=產生愈傷組織的外植體數/接種外植體總數×100%

愈傷量：++++表示愈傷組織體積是接種外植體的15-25倍；+++表示愈傷組織體積是接種外植體的10-20倍；++表示愈傷組織體積是接種外植體的5-10倍；+表示愈傷組織體積是接種外植體的0-5倍；

(3)觀察記錄叢生芽的生長情況，統計不同培養基對黑果枸杞愈傷組織或莖段誘導分化叢生芽的影響，篩選誘導率高且叢生芽質量好的最佳培養基。統計黑果枸杞叢生芽數、整齊度和增殖系數。

叢生芽數為接種的外植體上長出的芽個數；

整齊度：用差和齊表示，接種的外植體分化出的芽生長的高度一致即為齊，接種的外植體分化出的芽生長的高度不一致即為差；

增殖系數=增殖的芽數/接種數。

(4)觀察記錄葉片的生長情況，篩選葉片誘導率高且植株生長狀況最好的最佳培養基及其激素配比。統計葉片分化率。

葉片分化率=產生的植株數/接種葉片總數×100%

2 結果與分析

2.1 愈傷組織誘導

將黑果枸杞無菌苗的葉片和莖段剪切2-3個傷口后接種到表1的培養基中。培養室培養3-5 d后，莖段基部傷口處逐漸脫分化出現愈傷組織，呈緊密顆粒狀。葉片約7 d后變黃，傷口處逐漸脫分化形成愈傷組織，呈疏松顆粒狀。兩種外植體形成的愈傷組織15 d左右開始逐漸增多，45 d左右，愈傷組織量達到最大。無論用葉片，還是莖段做外植體，1-4號處理愈傷組織誘導率均為100%；5號處理愈傷組織誘導率均為0；6號處理用葉片做外植體愈傷組織誘導率為100%，莖段做外植體愈傷組織誘導率為25%；7號處理均有所下降(見表1)。

由表1可知，無論用葉片，還是莖段做外植體，低濃度的2,4-D能誘導出愈傷組織，并且隨著濃度的增加，誘導效果增強，愈傷量明顯變多；處理6中IBA使葉片和莖段誘導出愈傷組織，但愈傷量少、愈傷組織上有芽的分化，而莖段有叢生芽發生；處理7中NAA誘導葉片、莖段形成了少量愈傷，愈傷組織上均有芽的分化，IBA 、NAA，誘導莖段形成愈傷組織效果最差，2,4-D有利于愈傷組織誘導。

由此可見，以2,4-D 0.4 mg·L-1誘導葉片形成的愈傷組織最佳，以培養基2,4-D 0.3 mg·L-1誘導莖段形成的愈傷組織最佳，愈傷組織誘導率均為100%。

表1 激素處理對黑果枸杞愈傷組織誘導的影響

2.2 叢生芽誘導

2.2.1 利用愈傷組織誘導叢生芽 將生長狀態良好的愈傷組織轉接至表2的叢生芽誘導分化培養基中，15 d左右，愈傷組織分化形成叢生芽，表面分布少量綠色叢生芽點；30 d左右，愈傷組織上的大部分綠色叢生芽點開始分化形成叢生芽(見表2)。

表2為90 d的統計結果。由表可知，當KT濃度為0，6-BA濃度為0.5 mg·L-1時，黑果枸杞叢生芽的增殖效果最好，增值系數為47.1倍。KT對叢生芽的分化沒有顯著的影響。

2.2.2 利用莖段誘導叢生芽 將黑果枸杞無菌苗的莖段接種到表3的培養基中。培養3-5 d后，莖段分化叢芽，且生長快速。15 d左右，莖段基部開始分化出大量幼芽組織團塊。表3為60 d統計結果，不同激素及其濃度配比的培養基對黑果枸杞莖段誘導分化形成叢生芽有一定的影響。處理12芽增殖系數低，整齊度差；處理13和15雖然誘導的芽增殖系數高，但整齊度差；處理14，叢生芽整齊度好，增殖系數為32.3倍；處理16中不含激素，叢生芽誘導率為0；處理14的整體誘導叢生芽效果優于其它處理。

2.3 利用葉片誘導再生植株

將規格為0.5～1 cm2的葉片接種至表4的培養基中。表4為40 d記錄結果。由表4可知處理17、 18有愈傷組織形成，無再生植株形成；其余2種處理在葉片傷口的主葉脈處均形成了芽，處理19生根率為33.3%，植株再生誘導率26.6%；處理20生根率為66.7%，植株再生誘導率33.3%。 由此可見，處理19， 0.01 mg·L-1的NAA誘導葉片形成再植株的效果較好，誘導率為33.3%。

表2 激素處理對愈傷組織形成叢生芽的影響

表3 激素處理對莖段誘導叢生芽的影響

表4 激素處理對葉片誘導植株的影響

2.4 生根培養

叢生芽高度長至3 cm時，轉入MS培養基培養20 d均可長出3-4條根，幼苗生長健壯(見圖1)。

3 討 論

3.1 黑果枸杞的葉和莖段較易誘導愈傷組織

實驗發現，以葉和莖段為外植體時，在MS培養基上，添加2,4-D 0.1-0.4 mg·L-1均易誘導出愈傷組織，但IBA 、NAA，不利于誘導愈傷組織。冀菲[13]利用黑果枸杞剪掉根系的無菌苗在 MS+ 6-BA 1.0 mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1培養基中可以形成較好的愈傷組織, 其結果與本實驗不同。此外，本實驗在低激素MS+6-BA 0.2 mg·L-1+IBA 0.01 mg·L-1培養基中形成的是叢生芽，其結果的不同可能與品種和光照時間不同有關。

圖1 MS培養基植株生根效果Fig.1 Rooting effect of plants in MS medium

3.2 選擇適宜的外植體有利于叢生芽誘導

愈組誘導叢生芽的過程中，玻璃化現象嚴重，可能由于細胞分裂素含量高，導致增殖系數太高，迫使叢生芽生長的過程中在營養需求量大，代謝物積累增多和生長空間不足，對生長產生了不利影響。本實驗光照時間為15h，曹有龍等[16]認為紅果枸杞的適宜光照時間為12 h，培養瓶內濕度過大，凝結成小水滴后可能都提高了玻璃化發生率，因此，不建議利用愈組誘導叢生芽這種途徑。冀菲[13]認為6-BA 高于0.6 mg·L-1時增殖率開始下降；當培養基中6-BA 質量濃度為0. 4 mg·L-1時增殖效果最好，本實驗篩選出6-BA 質量濃度為0.5 mg·L-1時增殖效果最好, 與冀菲實驗結果基本一致，而冀菲未提到玻璃化現象的發生。利用莖段誘導叢生芽的過程中，與愈組誘導叢生芽的培養條件相同，但未發生玻璃化現象。Sun[14]等認為利用黑果枸杞幼苗莖段為外植體時，使用6-BA易產生玻璃化苗，但本實驗中采用了6-BA 0.2 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1和6-BA 0.2 mg·L-1+IBA 0.01 mg·L-1激素配比沒有產生玻璃化苗，且繁殖系數高達32倍之多，可能是組培品種不同所致。

3.3 利用葉片直接誘導再生植株

郭輝[17]認為紅果枸杞葉片不能分化產生芽。馬和平等[18]以“寧杞 2 號”葉片為試材，研究了其再生體系，認為紅果枸杞直接從葉片上可分化產生芽，與本實驗結果一致。由于品種不同激素搭配不同，黑果枸杞在單獨使用IBA 0.01 mg·L-1和NAA 0.01 mg·L-1的培養基上，葉片首先在主葉脈傷口處長出根系，待根系長到一定長度后，葉片不經過脫分化的過程，直接生成再生植株，也可按馬和平等方法將苗切下進行生根。這個現象初步說明了黑果枸杞葉片的再生能力較強，此途徑為植物遺傳轉化奠定了基礎。