低 C／N 馴化生物絮團的自養和異養硝化性能研究

王 濤，劉青松，段亞飛，李 華，董宏標，張家松，3

（1．中國水產科學研究院南海水產研究所，農業農村部南海漁業資源開發利用重點實驗室，廣東廣州 510300；2．水產科學國家級實驗教學示范中心，上海水產養殖工程技術研究中心，農業農村部魚類營養與環境生態研究中心（上海海洋大學），上海 201306；3．中國水產科學研究院南海水產研究所深圳試驗基地，廣東深圳 518121）

中國是世界水產養殖大國，養殖過程中殘餌和糞便及其被微生物分解產生的氨氮N）、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮等無機氮大量排放是造成養殖水質惡化、病害頻發的重要因素［1－4］。為解決這一問題，利用生物絮團技術（biofloc technology）調控養殖水質以減少換水的養殖模式提供了新的思路［5－7］。

生物絮團對養殖水中有害氮的去除，與絮團內的微生物菌群結構密切相關，主要包括同化、自養硝化、異養硝化、反硝化等生化過程［8－9］。現有的生物絮團培養方式，大多通過調控C／N大于15來富集培養異養微生物，有害氮素去除以同化作用和異養硝化作用為主［10－11］。近年來，有研究者提出定向馴化自養硝化型生物絮團，以減少外碳源添加和溶解氧（DO）消耗，節約成本［12］。有研究表明，水產養殖系統中，超過50%的投喂飼料以殘餌、糞便等形式排入水體，經微生物分解釋放的化學需氧量（COD）占飼料的39%～44%［13－14］。養殖水體中碳源的含量與飼料組分密切相關，商品魚蝦配合飼料中蛋白質含量為35%時，C／N比值為8．9；蛋白質含量為30%時，C／N比值為10．4；蛋白質含量為25%時，C／N比值為12．5［15］。一般認為，自養硝化細菌的硝化活性比異養菌高103～104倍，而異養硝化菌生長速率快，在環境中的數量大，可彌補異養硝化菌活性低的不足［16］。因此，以低 C／N條件馴化的生物絮團，其自養硝化和異養硝化作用對有害氮素的去除效能哪種更高，很值得進一步研究。

本實驗接種羅非魚養殖池的生物絮團，以高蛋白飼料為氮源，赤砂糖為碳源，并通過逐漸降低赤砂糖添加量，調節C／N逐步從15降至7．9，以模擬養殖水體中相對較低的C／N環境，進行馴化培養。在此基礎上，對其自養硝化和異養硝化兩種生化過程的存在情況進行研究，并對其氮去除效能進行綜合評價，以期為生物絮團脫氮功能菌定向培養及其在養殖水處理中的應用提供參考。

1 材料與方法

1．1 實驗裝置與菌種來源

硝化性能實驗于有效容積28 L的圓筒型有機玻璃反應器（圖1－A）中進行，好氧反硝化性能實驗采用3個有效容積3 L的抽濾瓶（圖1－B），硝化反應和好氧反硝化反應過程均采用功率為100 W、曝氣量40 L·min－1的增氧泵（日生LP100）進行曝氣。每個反應設置3組平行，結果取平均值進行計算統計。

圖1 實驗裝置圖Fig．1 Experimental device diagram

初始所用菌種取自工廠化羅非魚養殖系統的生物絮團，投加飼料（C：43．64%，N：7．81%，粗蛋白含量≥48%）進行培養，添加量以實際養殖情況下生物絮團處理的有機氮負荷進行核算，為0．1 g·g－1（即每克生物絮團添加 0．1 g飼料），以赤砂糖（C：36．28%）為外加碳源，通過調節赤砂糖和飼料質量比來調控C／N，進行為期240 d的馴化培養。整個馴化過程分為3個階段：第一階段為0～30 d，C／N維持在15左右（赤砂糖∶飼料≈2∶1）；第二階段為 30～90 d，C／N維持在10．5（赤砂糖∶飼料≈1∶1）；第三階段為 90～240 d，C／N為7．9（赤砂糖∶飼料≈0．5∶1）。水質檢測結果顯示，整個馴化周期內NH4＋-N維持在0．50 mg·L－1以下，NO2－-N在 0．10 mg·L－1左右波動，可以滿足養殖水質要求［17－19］。

1．2 實驗方法

1．2．1 自養硝化性能實驗

1）取3份20 L經富集培養的生物絮團，測定其特性為：絮團懸浮物固體濃度（MLSS）＝2860 mg·L－1，絮團懸浮物揮發性固體濃度（MLVSS）＝2 077 mg·L－1，污泥體積指數（SVI）＝43．70 mg·L－1，污泥沉降比（SV）＝12．50%，MLVSS／MLSS＝72．61%。用自來水反復沖洗5次，移入圖1－A所示反應器中，饑餓處理12 h后，以NH4Cl為氮源，調整 NH4＋-N 約 為 8．00 mg·L－1。定時監測反應器中三氮（NH4＋-N、NO2－-N、NO3－-N，下同）及 pH、DO、COD、堿度等變化情況，以測定生物絮團的自養氨氧化（autotrophic ammonia oxidation，AN-AO）性能。

2）取3份20 L經富集培養的生物絮團，測定其特性為：MLSS＝2 547 mg·L－1，MLVSS＝1 768 mg·L－1，SVI＝50．38 mL·g－1，SV＝12．83%，MLVSS／MLSS＝69．42%。用自來水反復沖洗5次，移入圖1－A所示反應器中，饑餓處理12 h后，以NaNO2為氮源，調整NO2－-N約為10．00 mg·L－1。定時監測反應器中三氮及pH、DO、COD、堿度等變化情況，以測定生物絮團的自養亞硝酸鹽氧化（autotrophic nitrite oxidation，AN-NO）性能。

1．2．2 異養硝化性能實驗

取3份20 L經富集培養的生物絮團，測定其特性為：MLSS＝2 777 mg·L－1，MLVSS＝1 853 mg·L－1，SVI＝44．41 mL·g－1，SV＝12．33%，MLVSS／MLSS＝66．73%。用自來水反復沖洗5次，移入圖1－A所示反應器中，饑餓處理12 h后，以NH4Cl為氮源、赤砂糖為碳源，調節C／N至16，NH4＋-N初始濃度 8．00 mg·L－1。定時監測反應器中三氮及pH、DO、COD、堿度等變化情況，以測定異養氨氧化（heterotrophic ammonia oxidation，HN-AO）性能。

1．2．3 好氧反硝化

取2 L經富集培養的生物絮團，測定其特性為：MLSS＝3 977 mg·L－1，MLVSS＝2 383 mg·L－1，SVI＝46．10 mL·g－1，SV＝18．33%，MLVSS／MLSS＝59．92%。用自來水反復沖洗清洗5次，移入圖1－B所示反應器中，以NaNO3為氮源，赤砂糖為碳源，調節C／N至16，-N質量濃度約20 mg·L－1。定時監測反應器中-N、NO3－-N及pH、DO、COD、堿度等變化情況，以測定生物絮團的好氧反硝化（aerobic denitrification，AD）性能。

1．3 檢測指標及方法

1．3．1 檢測分析NH4＋-N：水楊酸法（哈希氰尿酸-水楊酸試劑粉包）；：N-（1-萘基）-乙二胺光度法；：麝香草芬分光光度法；COD：重鉻酸鉀氧化法；總堿度：微量滴定法；MLSS：恒量稱重法；SV：沉降法；MLVSS：高溫灼燒法；pH、DO、T：哈希HQ40D多參數溶氧儀［20］。

2）比氨氧化速率（special ammonia oxidizing rate，SAOR）、比亞硝酸鹽氮氧化速率（special nitrite oxidizing rate，SNOR）、比硝酸鹽還原速率（special nitrate reduction rate，SNiRR）依據下式計算［22－24］：

2 結果與分析

2．1 自養硝化性能

2．1．1 自養氨氧化性能

生物絮團自養氨氧化性能如圖2所示。從圖2可以看出，NH4＋-N質量濃度隨時間延長呈快速降低趨勢，6 h時，質量濃度由7．06 mg·L－1降至 0．47 mg·L－1，ARE為 93．42%；至8 h時，濃度維持在 0．21 mg·L－1，ARE達 97．10%。NO2－-N濃度隨時間延長出現輕微升高，至4 h時達到峰值，為 0．44 mg·L－1；隨后開始降解，8 h時降至0．02 mg·L－1。作為硝化反應的最終產物，隨降解而逐漸累積，從0 h的 5．28 mg·L－1升至 8 h的 14．51 mg·L－1。DO、pH變化情況如圖3所示，DO在整個實驗過程中基本穩定，均大于 8．00 mg·L－1，處于高DO狀態；pH從0到8 h出現了一定程度的降低。

圖2 自養氨氧化性能Fig．2 Performance of AN-AO

圖3 自養氨氧化DO和pH變化Fig．3 Dynam ics of DO and pH in the AN-AO

2．1．2 自養亞硝酸鹽氧化性能

圖4 亞硝酸鹽氧化性能Fig．4 Performance of AN-NO

圖5 亞硝酸鹽氧化DO和pH變化Fig．5 Dynam ics of DO and pH in the AN-NO

2．2 異養硝化性能

2．2．1 異養硝化性能實驗

圖6反映了微生物以赤砂糖為外加碳源、氯化銨為氮源時，反應器內三氮、ARE和（和的 積 累 量 與的轉化量之比）的變化情況。可以發現，生物絮團表現出良好的去除性能。經過2．5 h反應，質量濃度降至0．03 mg·L－1，ARE接近100．00%。在0．5 h內上升至2．62mg·L－1，后又快速降低，在3 h降低至0 mg·L－1。呈現先降低后升高，最后趨于平穩，前0．5 h從初始質量濃度的4．37 mg·L－1降低到3．03 mg·L－1；0．5 h后開始緩慢上升，至2．5 h濃度增加至 6．08 mg·L－1而趨于平穩狀態。而的變化情況為在0．5 h達到最高值0．71，后逐漸降低，直至8 h，的積累量比轉化量為0．23。

由圖7中DO與pH變化情況表示，加入碳源，系統中DO和pH快速降低。隨著反應的進行，DO和pH值曲線出現相吻合的特征凹點（分別標記為C和c），0．5 h后又趨于平穩。

2．2．2 好氧反硝化

圖9為pH和DO的變化情況。DO在反應開始階段迅速降低，0．2 h降至最低，從7．93 mg·L－1降至 6．28 mg·L－1，而后開始逐漸升高，至2 h時升至接近初始值。pH出現些微下降，至0．4 h從7．39降至最低值 7．02，0．4 h以后又開始緩慢升高，2 h時升至7．51。

圖6 異養硝化性能Fig．6 Performance of HN-AO

圖7 異養硝化DO和pH變化Fig．7 Dynam ics of DO and pH in the HN-AO

圖8 好氧反硝化性能Fig．8 Performance of AD

圖9 好氧反硝化DO和pH變化Fig．9 Dynam ics of DO and pH in the AD

2．3 自養和異養硝化特性對比

2．3．1 氮降解速率、NiAR和 TIN去除

如圖10所示，以氮化合物滿足養殖水質要求時為終止點，各氮化合物濃度與反應時間均呈現線性相關關系，自養氨氧化、自養亞硝酸鹽氧化、異養氨氧化與時間相關性 R2分別為0．99、0．99和0．98（P＜0．05）。

圖11－A為自養硝化與異養硝化過程中NiAR隨時間的變化情況。異養硝化過程中，NO2－-N積累明顯，在0．5 h時NiAR達到峰值，為46．37%，而后開始降低，2．5 h約降為0。自養硝化過程，NO2－-N沒有明顯的積累，4 h時NiAR達到最大值，但僅為3．31%。

圖11－B是不同反應過程中TIN的變化情況，異養硝化過程的TIN去除率遠大于自養氨氧化過程。自養氨氧化過程中，反應結束時的TIN為14．73 mg·L－1，較初始的 12．82 mg·L－1略高；亞硝酸鹽氧化過程TIN從初始濃度12．94 mg·L－1降至 11．80 mg·L－1，去除率為 8．81%；而異養硝化過程 TIN從 11．10 mg·L－1降至 5．96 mg·L－1，去除率達 53．69%。

圖10 氮素降解速率Fig．10 Nitrogen degradation rate

圖11 亞硝酸鹽氮積累率和總無機氮去除率Fig．11 NiAR accumulation rate and TIN removal rate

2．3．2 堿度和 COD的消耗

圖12－A為自養硝化與異養硝化過程中堿度消耗情況。從圖12－A中可見，自養硝化、亞硝酸鹽氧化及異養硝化堿度初始值分別為128．20 mg·L－1、109．87 mg· L－1及 122．25 mg·L－1（以 CaCO3計），實驗結束時，分別為98．30 mg·L－1、84．01 mg·L－1及 99．32 mg·L－1。根據 NH4＋-N、NO2－-N降解量及堿度的消耗量，可核算得到每降解1 g NH4＋-N，自養硝化、亞硝酸鹽氧化和異養硝化過程分別消耗4．30 g、2．49 g和3．34 g堿度。

圖12－B反映了不同反應過程中COD消耗情況。自養氨氧化和亞硝酸鹽氧化過程無外加碳源，僅對反應器中殘留的COD進行消耗，COD從初始的 40．14 mg·L－1和 35．14 mg·L－1分別下降到結束時的 23．95 mg·L－1和 11．57 mg·L－1。而異養硝化過程COD從初始的154．43 mg·L－1降至 24．90 mg·L－1。

圖12 堿度和COD的消耗對比Fig．12 Comparison of alkalinity and COD consumption

3 討論

3．1 自養硝化性能

本實驗研究結果說明了以低C／N馴化的生物絮團具有較好的全程硝化性能，NO2－-N累積量少，自養氨氧化實驗期間質量濃度變化均在羅非魚可承受范圍內·L－1）［17－18］，pH降低程度大于自養亞硝酸鹽氧化過程，需進行調節，該現象可能是因為絮團微生物細胞合成時，全程硝化的生化反應過程分為兩階段，反應式如下［25］：

式（4）～式（5）中：C5H7NO2代表微生物菌體的化學方程式，硝化反應對堿度的消耗主要發生在第一階段，即自養氨氧化過程微生物需要消耗更多的堿度，導致該階段pH降低程度多于自養亞硝酸鹽氧化過程。自養硝化性能實驗的氨氮降解情況也表明以低C／N馴化生物絮團可以定向富集出自養硝化菌。

3．2 異養硝化性能

對于異養硝化反應過程中，DO和pH出現相吻合的最低值C和c。主要是由于反應初期，COD充足，生物絮團中的異養微生物呼吸代謝旺盛，消耗了大量的DO，使得水中復氧速率小于DO的消耗速率，導致DO降低，而呼吸作用加劇意味著會釋放出更多的CO2，溶于水體，導致水體pH下降。隨著水中COD的消耗，微生物呼吸作用減緩，DO消耗降低，水中復氧速率大于DO消耗速率，DO濃度上升，直至恢復初始水平，而實驗過程中采用氣泵增氧對微生物呼出CO2存在吹脫作用，系統中CO2的量減少，可能是使得pH再次上升的原因。

另外，為了研究2．2．1所述異養硝化反應前期NO3－-N質量濃度下降以及反應過程中降低的問題，開展了在初始DO維持8．00 mg·L－1條件下，以赤砂糖為碳源，NaNO3為氮源進行好氧反硝化實驗驗證。實驗研究得到 NaRE為27．85%，這說明在 COD和存在的情況下，本實驗中馴化的生物絮團存在好氧反硝化作用。因為好氧反硝化過程會補充部分堿度，導致該過程pH波動小于異養硝化過程。劉文暢等［30］以生物絮團反應器作為中試規模循環水養殖系統的唯一水處理裝置時，發現了好氧反硝化優勢菌種Hydrogenophaga和Terrimonas，也表明生物絮團中好氧反硝化是有可能存在的。

3．3 自養硝化和異養硝化特性對比

自養硝化和異養硝化對無機氮均有著良好的降解效能。為進一步對比自養和異養過程中氮的去除速率，本實驗對反應過程中各形態氮濃度隨時間的變化規律進行線性擬合。在此基礎上計算自養 SAOR、SNOR和異養SAOR分別為13．17 mg·（gVSS·d）－1、29．20 mg·（gVSS·d）－1和40．28 mg·（gVSS·d）－1。由此可見，在自養硝化過程中，SAOR＜SNOR，氨氧化過程為自養硝化反應的限速步驟，這解釋了圖2中NO2－-

N基本無累積的現象。異養SAOR為自養SAOR的3．06倍，即異養硝化過程可實現NH4＋-N的快速降解。然而，異養硝化過程中NiAR會出現快速積累現象，而自養硝化不會出現明顯的積累。這說明添加碳源的異養硝化過程中，碳源的存在可能會短暫抑制NO2－-N的氧化，而當碳源被異養硝化菌利用后，NO2－-N才開始被氧化。也有可能加入碳源后，亞硝酸鹽氧化菌代謝通路會受到一定的影響，導致響應時間增長，出現了前期的積累。

對比自養硝化和異養硝化TIN變化情況，發現自養氨氧化TIN結束值高于初始值，分析原因可能為反應初始階段為微生物對NH4＋-N的吸附階段，從而使測得的TIN比實際值偏低。隨后微生物對所吸附含氮化合物的釋放，使得后續測得TIN值較初始值略高［31］。亞硝酸鹽氮氧化過程TIN去除率僅為8．81%，而異養硝化過程TIN去除率為53．69%。這主要是由于在有機碳源存在條件下，異養硝化產生了NO3－-N可能會使好氧反硝化作用繼續發生。異養硝化和好氧反硝化的耦合反應，有利于養殖水中無機氮的徹底脫除。自養硝化-好氧反硝化這一反應特性可能也是導致異養硝化堿度消耗低于自養硝化的原因，因為多數異養硝化菌亦是好氧反硝化菌，反硝化過程產生堿度，在一定程度上補充硝化過程中消耗的堿度［26］。一般來說，生物絮團培養過程中，為了提高氮轉化效率，堿度需提高至150 mg·L－1以上［32］。FURTADO等［33－34］研究證實水體堿度低于100 mg·L－1時，不利于生物絮團系統中硝化菌的硝化反應，而150～300 mg·L－1的堿度水平更利于生物絮團的形成及硝化菌落的建立。

綜上，從環境效益的角度分析，異養硝化對NH4＋-N去除速率快，且和好氧反硝化有耦合反應，有利于養殖水中無機氮素的徹底脫除，降低養殖水的富營養化潛勢。從經濟效益的角度分析，異養硝化反應過程DO波動劇烈，意味著原位處理養殖水的情況下，為保證養殖生物安全，需要更多DO供給，電耗更高。此外，異養硝化能節約一定的堿度添加量，但需要消耗大量外加碳源。鑒于此，如何優化現有的生物絮團養殖工藝，調控自養和異養硝化比例，實現環境效益和經濟效益兼顧，還需進一步研究。

4 小結

1）低C／N馴化培養的生物絮團具有優良的無機氮去除效能。最終AN與HN-AD的ARE分別為97．10%、100．00%，NiRE為100．00%。

2）生物絮團的HN對NH4＋-N的降解速率要快于 AN，自養 AOR、NOR和異養 AOR分別為1．14 mg·（L·h）－1、2．15 mg·（L·h）－1、3．11 mg·（L·h）－1；HN-AD的耦合作用，有利于養殖水中無機氮的徹底脫除。