不同種群密度地區長足大竹象生殖系統的超微結構研究

梁爽， 龍文聰， 梁梓， 羅朝兵， 劉安萱， 廖鴻， 楊瑤君

(樂山師范學院生命科學學院，竹類病蟲防控與資源開發四川省重點實驗室，四川樂山614004)

長足大竹象Cyrtotrachelusbuqueti是竹林毀滅性害蟲，自2003年一直被列為我國林業危險性有害生物之一。據調查，四川省樂山市叢生竹林面積667 km2，長足大竹象平均蟲口密度為0.49頭/筍(楊瑤君等，2011)，而貴州省赤水市叢生竹林面積820 km2，平均蟲口密度低于0.01頭/筍。兩地相距不足300 km，蟲口密度卻相差48倍。生殖是維持昆蟲種群密度的關鍵環節之一，生殖系統結構的變化可能導致昆蟲繁殖能力或種群數量的顯著變化。2014—2017年，本課題組在田間調查時觀察到赤水地區長足大竹象雌蟲產卵數量較少，其生殖器官的結構是否發生了顯著變化？其變化特點如何？

近年對長足大竹象的研究主要集中在頭部感器的超微結構(楊瑤君等，2010)、成蟲體表信息化學物質的提取和鑒定(忙定澤，2012)、營養成分(蒲遠鳳等，2015)、繁殖性能(楊樺等，2015)與生物學特性及防治(聶學文，2010)等方面。在長足大竹象生殖系統方面，汪淑芳等(2009)對生殖結構形態解剖及梁梓等(2016)對生殖系統中雄性附腺的抑菌作用進行了研究。本文應用解剖及掃描電鏡技術觀察樂山高種群密度、赤水低種群密度長足大竹象生殖系統的形態特征和超微結構，比較二者的差異，以期分析赤水地區長足大竹象種群密度低的原因，為研究長足大竹象的種群特征和發生規律提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況及試驗材料

貴州省赤水市大同鎮位于市境西面，與四川省敘永縣、合江縣毗鄰，低中山地、丘陵地形，屬中亞熱帶溫暖濕潤季風氣候區，年均溫度18.2 ℃，年均降水量1 280 mm，海拔228～1 280 m，主要竹種有毛竹Phyllostachyspubescens、慈竹Neosinocalamusaffinis、撐綠竹Bambusapervariabilis×Dendrocalamusdaii、麻竹Dendrocalamuslatiflorus、孝順竹Bambusamultiplex等(王潤秋，2014)。四川省樂山市沐川縣大楠鎮屬淺丘區兼有低山，年平均溫度17 ℃，年均降水量1 333.9 mm，海拔336～818 m，主要竹種有慈竹、撐綠竹、綿竹Lingnaniaintermedia、苦竹Pleioblastusamarus等(陳其勇等，2014)。2016年7—8月長足大竹象出土盛期，分別在四川省樂山市沐川縣大楠鎮(104°0′6.93″E，28°58′5.06″N，海拔532 m)和貴州省赤水市大同鎮(105°40′40.12″E，28°30′28.33″N，海拔358 m)慈竹林中采集雌雄成蟲各15只，用取自兩地的新鮮慈竹筍分開成對喂養，交配后收集受精卵。飼養環境：溫度25 ℃、相對濕度75%、光周期12L∶12D，每2 d更換1次竹筍。

1.2 主要儀器及試劑

離子濺射儀Cressington108(Cressington，英國)、掃描電鏡Inspect F50(FEI，美國)、Leica EZ4 HD體視鏡(Leica，德國)等。所用試劑均為分析純，購自成都科龍化工試劑廠。

1.3 解剖及掃描電鏡觀察

長足大竹象內、外生殖器的解剖方法參照汪淑芳等(2009)，雌雄成蟲各取15只進行解剖、掃描電鏡觀察。解剖后的內、外生殖器用足量生理鹽水清洗3次后，放入4%多聚甲醛-磷酸二氫鈉/氫氧化鈉固定液中固定。參照楊瑞等(2014)的方法，將擬電鏡觀察的卵粒、雄性睪丸、雌雄性外生殖器等用固定液固定24 h以上，經30%、50%、70%、90%、100%乙醇進行逐級脫水，乙酸異戊酯置換處理10 min，經臨界點干燥儀干燥，將干燥好的樣品觀察面向上粘臺，用Cressington108 離子濺射儀真空噴金。將經上述處理過的樣品置于Inspect F50掃描電鏡下，觀察其生殖結構形態特征并拍照。

1.4 數據統計與分析

用SPSS 16.0、Excel對數據進行統計分析，運用t檢驗進行差異顯著性分析。利用ImageJ對卵細胞和精細胞直徑、密度及外生殖器的長度等進行測量，數據以平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 生殖系統形態對比

樂山、赤水兩地長足大竹象雌性成蟲生殖結構均由1對卵巢、1對側輸卵管、中輸卵管、交配囊、受精囊及產卵器組成，卵巢左右并列，呈乳白色，每個卵巢由2只卵巢管組成，卵巢管長約2.8 cm，每只卵巢管下端卵粒大而飽滿，向上逐級減小，5～6粒卵，每側卵巢管端絲匯成懸帶；雄性成蟲生殖結構均由1對睪丸、輸精管、射精管、附腺及外生殖器組成，每側睪丸由2只扁球狀睪丸管組成(圖1)。兩地雌雄成蟲生殖系統在形態結構上未觀察到顯著差異。

2.2 內生殖器超微結構

2.2.1雌蟲卵黃顆粒對雌性長足大竹象受精卵內部進行電鏡掃描，可見大量呈橢圓形或圓形的卵黃蛋白充塞在原生質網絡內。電鏡放大300倍，觀察到樂山地區卵黃顆粒(圖2：A)較赤水地區(圖2：D)密實，放大至3 000倍、10 000倍后，發現樂山雌蟲卵黃顆粒飽滿且表面光滑(圖2：B、C)，而赤水雌蟲卵黃顆粒表面粗糙、有鏤空(圖2：E、F)。測定卵黃顆粒密度、直徑，每萬立方微米內卵黃顆粒的平均密度為：樂山地區10.4個、赤水地區11.9個；卵黃顆粒平均直徑為：樂山地區20.76 μm±1.33 μm、赤水地區15.26 μm±1.99 μm，二者差異有高度統計學意義(P=0.000 145)。

2.2.2雄蟲睪丸樂山、赤水兩地雄蟲睪丸內部有明顯差異，樂山地區睪丸內壁較為光滑(圖3：A、B、C)，赤水地區睪丸內壁上有許多褶皺(圖3：D、E、F)，兩者內部均可觀察到精細胞。每萬立方微米內精細胞的數量為：樂山地區約400個、赤水地區約1 500個，相差近3倍；精細胞直徑為：樂山地區5.60 μm±0.51 μm、赤水地區3.31 μm±0.27 μm，二者差異有高度統計學意義(P=0.000 004)。

2.3 外生殖器超微結構

2.3.1雌蟲外生殖器掃描電鏡結構樂山、赤水兩地的產卵器鞘上均有成叢的剛毛，由產卵器鞘末端向上逐漸變短(圖4：A、D)，剛毛上著生刺狀凸起，剛毛區基部均勻著生芽狀小刺(圖4：B、E)，外生殖器中部有一片絨毛區(圖4：C、F)。分別測量其外生殖器長刺和小刺的長度、密度、絨毛區寬度等，兩地差異無統計學意義。

圖1 樂山(A、B)、赤水(C、D)地區長足大竹象生殖系統Fig. 1 Reproductive system of Cyrtotrachelus buqueti from Leshan (A， B) and Chishui (C， D)

A， C. 雌蟲female， B， D. 雄蟲male； ovp. 產卵器ovipositor， C. 中輸卵管common oviduct， L. 側輸卵管lateral oviduct， ov. 卵巢ovary， bc. 交配囊bursa copulatrix， S. 受精囊spermatheca， li. 懸帶ligament， pe. 陽莖penis， mu. 肌纖維鞘muscle fiber sheath， va. 輸精管vasa deferentia， sp. 睪丸管spermatic tube， te. 睪丸testis， ac. 附腺accessory gland

圖2 樂山(A～C)、赤水(D～F)地區長足大竹象雌性成蟲卵黃顆粒電鏡掃描Fig. 2 The egg of female Cyrtotrachelus buqueti from Leshan (A-C) and Chishui (D-F) as determined by using scanning electron microscopy

A， D. 300×， B， E. 3 000×， C， F. 10 000×

圖3 樂山(A～C)、赤水(D～F)地區長足大竹象雄性成蟲睪丸電鏡掃描Fig. 3 The testis of male Cyrtotrachelus buqueti from Leshan (A-C) and Chishui (D-F) as determined by using scanning electron microscopy

A， D. 5 000×， B， C， E， F. 10 000×

圖4 樂山(A～C)、赤水(D～F)地區長足大竹象雌性成蟲產卵器鞘電鏡掃描Fig. 4 External reproductive organs of female Cyrtotrachelus buqueti from Leshan (A-C) and Chishui (D-F) as determined by using scanning electron microscopy

A， D. 200×， B， E. 2 000×， C， F. 5 000×

2.3.2雄蟲外生殖器超微結構樂山、赤水兩地雄蟲外生殖器末端的陽莖均為黑褐色骨化管狀結構，向腹面彎曲，背面上半部骨化，下端為膜質區帶(圖5：A、E)，表面局部著生成叢的纖毛(圖5：B、F)。橫切面掃描電鏡觀察到陽莖為雙層結構，內層萎縮形成層間中空(圖5：C、G)，內層不規則卷迭，呈空腔結構，內陽莖壁不光滑，具有突起狀結構(圖5：D、H)。分別測量陽莖壁厚度、內陽莖壁凸數目等，兩地差異無統計學意義。

3 討論

形態解剖表明，樂山、赤水兩地不同種群密度的長足大竹象雌性成蟲生殖系統形態結構未觀察到顯著差異，掃描電鏡觀察兩地成蟲外生殖器超微結構也未觀察到顯著差異，但兩地成蟲卵黃顆粒、精細胞在形態結構上的差異有高度統計學意義。超微結構研究表明，赤水地區低密度種群雌蟲卵黃顆粒表面粗糙有鏤空，直徑顯著小于樂山地區高密度種群，赤水地區雄蟲睪丸內壁粗糙有褶皺，精細胞直徑極顯著小于樂山地區，每萬立方微米內精細胞的數量超過樂山地區的2倍。由此可知，與樂山地區相比，赤水地區成蟲生殖系統卵黃顆粒、睪丸的結構和大小及精細胞的數量均發生了顯著變化，這可能導致赤水地區種群的繁殖力下降，種群數量低。

環境因素、遺傳變異或遺傳變異與環境互作均可引起長足大竹象生殖系統結構發生變異。赤水地區大面積竹林為長足大竹象的種群繁育提供了充足的食物來源。若是遺傳變異導致種群數量大幅度降低，那么幸存個體在環境適宜、食源豐富的條件下應能大量繁殖，且長足大竹象是遷飛性昆蟲，通過遷飛，亦可使其種群數量增加(?stmanetal.，2001；Eckertetal.，2008；Spearetal.，2010；He & Hubbell，2011)。由此推測，由環境因素引起赤水地區成蟲睪丸、卵黃顆粒結構及精細胞大小產生變異的可能性較大。溫度是影響昆蟲生長發育和繁殖的重要因素之一，相關研究發現低溫會延緩雌性苜蓿葉象甲Hyperapostica(張娜等，2010)和甜菜夜蛾Spodopteraexigua(韓蘭芝等，2003)的性腺發育及卵子成熟；高溫影響雄性棉鈴蟲Helicoverpaarmigera精細胞囊、睪丸和附腺的發育，導致畸形精子束產生(郭慧芳等，2002)。緯度偏南的廣西南寧，年均溫度高于赤水，但慈竹林生長環境相似，長足大竹象種群數量仍高于赤水地區(梁祖昂，2017)。本研究發現，年均溫度相近的樂山和赤水兩地的長足大竹象成蟲在卵黃顆粒、睪丸的結構和大小及精細胞的數量等方面卻有顯著差異。由此推測，溫度等氣候因子導致兩地長足大竹象成蟲生殖結構變化的可能性不大。課題組實驗檢測還發現，赤水地區長足大竹象蛹室土壤中重金屬Hg的含量相對較高，為樂山地區的1.5倍以上(資料未發表)。大量研究表明，Hg影響酶活性，對生命活動、昆蟲種群可能造成毒害(沈維干，陳彥，2000；董杰影等，2004；樓哲豐等，2007)。長足大竹象的老熟幼蟲在地下蛹室化蛹羽化的時間長達11個月，蛹室土壤Hg含量顯著增加很可能會影響成蟲生殖器官的分化，進而導致生殖細胞結構發生變異，降低赤水地區種群的繁殖能力和種群數量。因此，土壤重金屬Hg含量的差異可能是導致兩地長足大竹象生殖系統結構發生顯著差異的重要原因，但還需進一步驗證。

圖5 樂山(A～D)、赤水(E～H)地區長足大竹象雄性成蟲外生殖器電鏡掃描
Fig. 5 External reproductive organs of maleCyrtotrachelusbuquetifrom Leshan (A-D) and Chishui (E-H) as determined by using scanning electron microscopy

A.陽莖基phallobase 43×， B. 陽莖基phallobase 150×， C. 陽莖橫切面penis transection 150×， D. 陽莖橫切面penis transection 1 000×，

E. 陽莖基phallobase 50×， F. 陽莖基phallobase 200×， G. 陽莖橫切面penis transection 200×， H.陽莖橫切面penis transection 1 000×

本研究首次比較了高、低種群密度地區地下生活史較長昆蟲長足大竹象生殖系統超微結構的變化特點，研究結果對研究長足大竹象種群變化、種群發生等具有現實參考價值。