基于物種敏感性分布法預測芘對白菜毒害的生態風險閾值

楊肖松，劉月仙*，解小凡，張 萌，王 偉

（1.中國科學院大學資源環境學院，北京 100049；2.中國礦業大學化學與環境工程學院，北京 100083；3.農業部環境保護科研監測所，天津 300191）

多 環 芳 烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是指兩個或兩個以上的苯環稠合在一起的一類化合物，主要由碳氫化合物經過不完全燃燒產生，大多數PAHs具有致毒、致癌和致突變的作用[1]。PAHs主要通過葉片和根皮層進入植物體內[2]，在植物體內遷移、代謝、積累，抑制植物種子萌發[3]、破壞植株體內的抗氧化系統以及降低光合作用[4]，進而影響植物的生長。多環芳烴也可通過食物鏈傳遞進入人體內，給人體健康帶來嚴重的危害。多環芳烴的致毒機理主要是PAHs脅迫使植物體內活性氧增加[5]，產生大量自由基[6]，導致細胞產生大量的活性氧簇（Reac?tive oxygen species，ROS）[7]。與低分子量 PAHs（≤3 個苯環）相比，高分子量PAHs（≥4個苯環）更難被降解而在土壤環境中長期存在[8]，對植物產生的毒害作用更大[9]。芘是帶有4個苯環結構的PAHs，是高分子量PAHs的典型代表，與PAHs總量有著良好的相關性[10]。對高環多環芳烴芘進行毒害風險評估，建立土壤芘對植物毒性的生態風險閾值，將為土壤環境污染基準的構建提供一定的科學依據。

物種敏感性分布法（Species sensitivity distribu?tion，SSD）是目前國際上制定相關環境標準的主要方法[11]。該方法是基于不同物種對同一污染物敏感性的差異，以多個有代表性敏感物種的急性或慢性毒性數據（EC10、EC50）為基礎，構建統計分布模型來評估環境濃度下污染物對生態系統的風險，從而獲得保護95%的物種不受影響情況下所允許的最大環境有害濃 度（HC5，Hazardours concentration for 5%of spe?cies）[12]。Silva等[13]運用SSD法評價土壤有機污染物三丁基錫對陸生生態系統的生態風險，得到土壤中的HC5為2.06 mg·kg-1。張曉惠等[14]基于SSD法開展了持久性8類污染物水生態風險閾值的研究，發現水生生物對不同化學物質的敏感度差異較大。然而，國內尚未發現運用SSD法推導土壤多環芳烴生態風險閾值的相關研究。

白菜是我國栽培面積最大的蔬菜，年種植面積267萬hm2左右，占全國蔬菜作物總種植面積的15%，占全國蔬菜總產量的18.8%[15]。因此研究土壤芘對白菜的毒性閾值具有重要的經濟意義。本文通過土培試驗，以華北地區11個常見的白菜品種為試驗對象，研究不同品種白菜在典型多環芳烴芘脅迫下的生長響應特征，建立劑量-效應關系，運用物種敏感性分布法推導出基于保護95%白菜品種的生態風險閾值，為我國蔬菜多環芳烴污染防治以及土壤限量標準提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試白菜為我國華北地區11個不同白菜品種：京翠60（JC-60），京秋65（JQ-65），京春娃2號（JCW-2），京春白（JCB），京翠70（JC-70），京春綠（JCL），北京桔紅二號（JH-2）7個品種種子購自北京市農林科學院京研益農種業科技有限公司；中白50（ZB-50），吉紅308（JH-308），菊心（JX），快菜1號（KC-1）4個品種種子購自中國農業科學院蔬菜花卉研究所。

供試土壤采自北京懷柔區中國科學院大學校區附近，風干后揀去枯枝石礫過3 mm篩，保存于陰涼處。

芘（GC，＞95%）購自上海阿拉丁生化股份有限公司。

1.2 試驗設計

1.2.1 白菜生長預試驗

稱取50 g土壤于直徑為90 mm玻璃培養皿中，芘濃度配制參照孫鐵珩等[16]推薦方法，配制完成后置于通風櫥中，待丙酮揮發至干。然后每皿放置15粒飽滿種子，置于25℃恒溫培養箱中培養。當空白對照發芽率達到65%，根的長度達到2 cm，試驗結束。通過芘濃度與根伸長的回歸方程y=7.241x0.314（R2=0.939 8），擬合劑量-效應曲線求得EC10與EC50，得出EC10=2.83 mg·kg-1，EC50=470.46 mg·kg-1。

1.2.2 土壤染毒試驗

正式染毒試驗芘的濃度參照孫鐵珩等[16]推薦的方法，要求至少設置5個不同的處理濃度（除對照外），范圍應在預試驗所求的EC10與EC50之間。本研究正式染毒試驗芘的添加濃度分別為0（對照）、5、15、45、135、405 mg·kg-16個處理水平。具體配制方法：稱取35 g芘于螺口瓶中，加入適量丙酮使其溶解后加入到10 kg土壤中，配制成芘濃度為3500 mg·kg-1的污染土壤，放入通風櫥內過夜，待丙酮完全揮發后，攪拌混勻，保存于-20℃冰箱中備用。將該芘濃度的土壤用未污染土壤進行不斷稀釋，攪拌均勻，最后配制成試驗所需的不同處理濃度。分別稱取不同芘濃度土壤7 kg于上口直徑為227 mm、下口直徑為207 mm、高為180 mm的花盆中，澆水保持土壤濕潤平衡一周。為保證白菜正常生長，每盆添加肥料KCl 0.32 g、KH2PO43.07 g、CO（NH2）22.24 g。平衡一周后，各個處理土壤中芘實際濃度見表1，空白對照土壤中芘有檢出，但芘在土壤中＜0.4 mg·kg-1時，可忽略不計[17]。其余處理芘實際濃度較添加濃度均有一定降低。

表1 供試土壤平衡一周后芘實際濃度Table 1 The concentration of pyrene in experimental soil after one week

1.2.3 白菜培養試驗

白菜種子經75%酒精浸泡5 min，用蒸餾水洗凈后再浸泡于55℃水中，并且不斷攪拌。每盆播種15粒白菜種子，待白菜長出四片真葉后間苗，每盆留1株幼苗，每個品種重復3次。待白菜成熟時，分別采集土壤和植株樣品，立即保存于-20℃冰箱中，共歷時80 d。

1.3 試驗方法

1.3.1 生物量（鮮質量計）測定

本試驗以鮮質量來表示白菜生物量。白菜植株收獲后，先用自來水沖洗植株，然后用去離子水沖洗，最后用天平稱取植株質量。

1.3.2 土壤芘測定

土壤樣品前處理及測定條件：土壤樣品冷凍干燥，研磨過80目篩后保存于-20℃冰箱中。取2 g上述制備的土壤樣品于25 mL玻璃離心管中，加入10 mL二氯甲烷，蓋緊后超聲萃取1 h；恒溫振蕩30 min，以4000 r·min-1離心10 min。取1 mL上清液過佛羅里硅土小柱凈化，用10 mL二氯甲烷∶正己烷=1∶1混合溶液洗脫，氮吹至干，用二氯甲烷定容至2 mL，GC-MS測定。

氣相條件：30 m×0.25 mm×0.25 μm TG-1MS色譜柱，載氣He，進樣口溫度280℃，不分流進樣，初始溫度40℃，保持1 min，以30℃·min-1速度升溫至150℃，接著以10℃·min-1速度升溫至290℃，并在此溫度下保持20 min。

質譜條件：EI電子源70 eV，離子源溫度280℃，傳輸線溫度280℃，掃描方式SIM[18]。

1.3.3 劑量-效應曲線擬合

土壤中芘植物毒性劑量-效應曲線采用Log-lo?gistic分布模型進行擬合[19]。該模型擬合參數均與實際生物效應有關，被廣泛應用于劑量-效應曲線擬合[20]。

式中：Y為各個處理水平的白菜鮮質量與對照鮮質量比值，%；a、b為擬合參數，a反映了對照和低劑量之間的毒性效應，b為曲線的斜率，b值越大說明隨著毒害劑量增加生物反應率迅速增加；X為土壤中芘實測濃度，mg·kg-1；M為效應濃度（ECx）的自然對數值。

當低劑量芘對白菜生長產生刺激效應時，上述模型不能夠很好地擬合實驗數據，因此采用Brain-Cousens模型[21]，擬合方程如下：

式中：Y為各個處理水平的白菜鮮質量與對照鮮質量比值，%；X為土壤中芘實測濃度，mg·kg-1；a、b、c、d為方程參數，a表征反應率上限和下限值之差，b表征低劑量區間效應增加趨勢，d為ECx的變化率。當k為10、50時，參數c定義為EC10及EC50。

1.3.4 物種敏感性分布曲線擬合

物種敏感性分布曲線采用USEPA開發的SSDGenerater V1軟件進行擬合[22]，該軟件利用的是logprobit模型。目前，用于進行SSD分析的函數模型很多，如 Log-logistic、Log-normal、Gompertz、Weibull和指數函數等。到目前為止，還未發現一個特定的分布模型是適合所有的毒性數據集的擬合。鄭師梅等對SSD法利用評估模型ETX2.0、BurrliOZ2.0、SSD Gener?ator V1開展苯系物淡水水質基準推薦值的比較研究發現，不同方法推導出的基準值沒有數量級的差異，但使用的模型不同，擬合出的曲線不同，得出的基準值也不盡相同。目前還沒有一種適合所有毒性數據的模型，因此很難去界定模型的優劣。相對而言，SSD Generator V1與其他兩種評估模型相比，在計算的時候可直接給出擬合度，能夠給出模型擬合程度的直接評判[23]。

1.4 數據處理及分析

采用Excel 2007、SPSS 19.0進行數據處理方差分析，利用1stopt軟件進行模型參數估計，Origin 2017進行方程擬合及圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 不同品種白菜土壤芘含量的變化

從表2可以看出，不同品種白菜土壤芘殘留量差別較大。在芘處理濃度為5 mg·kg-1條件下，種植不同白菜品種土壤芘濃度在0.41～1.89 mg·kg-1之間變化，相差3.61倍。其中JH-2品種芘殘留濃度最大為1.89 mg·kg-1，JC-70、JX品種芘殘留濃度最小，均為 0.41 mg·kg-1；在芘處理濃度為15 mg·kg-1時，JH-2品種芘殘留濃度最大為5.34 mg·kg-1，JC-70品種芘殘留濃度最小為1.27 mg·kg-1；同樣在芘處理濃度為45 mg·kg-1和405 mg·kg-1時，JH-2品種的土壤中芘殘留濃度均達到最大值，分別為 14.85 mg·kg-1和189.72 mg·kg-1，品種JX、KC-1土壤芘殘留濃度最小，分別為4.82 mg·kg-1和 114.14 mg·kg-1；在芘處理濃度為 135 mg·kg-1時，芘殘留濃度最大和最小的品種分別為JC-60（66.83 mg·kg-1）和KC-1（31.27 mg·kg-1）。可見，在添加相同濃度芘條件下種植不同白菜品種，土壤中芘殘留量存在較大差別，可能是芘對不同白菜品種的毒性不一樣，也可能與白菜對多環芳烴的抗逆性有關。

2.2 土壤多環芳烴芘對白菜生物量（鮮質量）的影響

從圖1可以看出，隨著土壤中外源芘的濃度增加，不同品種白菜的生物量（鮮質量）呈現出不同的變化趨勢。本實驗結果表明，JCW-2、JCB、JC-70、JCL、JH-2、ZB-50、JH-308、JX、KC-1 9個品種隨著芘的添加濃度增加呈現出先升高后降低的趨勢，而JC-60和JQ-65生物量（鮮質量）隨著芘處理濃度的增加逐漸降低，呈現抑制效果。在芘處理濃度為5 mg·kg-1時，JC-60、JCB和JX 3個品種的鮮質量跟對照相比有著顯著性差異（P＜0.05），其中JC-60生物量跟對照相比有顯著降低，其余白菜品種在芘處理濃度為5 mg·kg-1時與對照相比無顯著性差異（P＞0.05）。JCW-2、JC-70和JH-308 3個品種白菜在外源芘添加量為15 mg·kg-1時生物量達到最大值,相比對照分別增加了21.11%、16.11%和20.43%。JCL、JH-2、JX、ZB-50和KC-1品種在芘處理濃度為45 mg·kg-1時生物量達到最大值，且與對照相比有顯著差異。當土壤中芘添加濃度達到405 mg·kg-1時，9個不同品種的白菜生長（鮮質量）產生顯著的抑制效應（P＜0.05），抑制率分別為59.25%、47.95%、75.84%、29.34%、44.16%、19.50%、40.77%、25.12%、46.45%。

2.3 基于白菜生物量（鮮質量）測試終點的芘毒性劑量-效應曲線

通過Log-logsitic模型以及Brain-Cousens模型對土壤中芘植物毒性的劑量-效應關系進行擬合，得出不同條件下芘對白菜毒性的劑量閾值（EC10、EC50）。從圖2可以看出除品種JC-60和JQ-65隨著多環芳烴芘的增加呈現抑制效應外，其余白菜品種生物量隨著芘的濃度增加呈現先升高后降低的趨勢。從表3可以看出多環芳烴芘對不同白菜EC10變化范圍為4.14～52.76 mg·kg-1。其中 JQ-65 品種 EC10值最小為4.14 mg·kg-1，ZB-50 品種 EC10值最大為 52.76 mg·kg-1，相差11.74倍。多環芳烴芘對11種白菜毒性閾值EC50變化范圍為28.35～545.11 mg·kg-1，從大到小的順序依次是 JH-308＞JH-2＞JC-70＞JCB＞ZB-50＞JX＞JC-60＞JCL＞JQ-65＞KC-1＞JCW-2，最大值和最小值相差18.23倍。

表2 種植不同品種白菜的土壤中芘殘留濃度（mg·kg-1）Table 2 The residual concentration of pyrene in soil after planting different varieties of Chinese cabbage（mg·kg-1）

圖1 多環芳烴芘添加對白菜生物量（鮮質量）的影響Figure 1 The effect of pyrene on the biomass（fresh weight）of various cabbage

2.4 基于毒性閾值（EC10、EC50）的白菜物種敏感性分布及HC5值預測

構建單一污染物SSD曲線模型的方法主要包括基于確定概率的參數模型法和基于抽樣分布的非參數模型法。本文利用USEPA推薦物種敏感性分布軟件SSD-GeneraterV1對不同品種白菜芘的毒性閾值（EC10、EC50）進行擬合，得到SSD曲線（圖3）。從SSD曲線可以看出，不同的白菜品種在芘的脅迫下表現出不同敏感性，品種ZB-50對芘的脅迫表現出較強的抗性，而JCW-2、JQ-65、JC-60對芘較為敏感。基于毒性閾值EC50的SSD曲線不同白菜對芘的物種敏感性順序分別為JC-60＞JCW-2＞JQ-65＞JH-308＞JX＞JCB＞JH-2＞JCL＞JC-70＞KC-1＞ZB-50，而基于EC10敏感性順序為JQ-65＞JC-60＞JCW-2＞JH-308＞JX＞JCL＞JCB＞JC-70＞KC-1＞JH-2＞ZB-50，品種JQ-65分布頻次略有降低，JH-2分布頻次略有升高。

通過物種敏感性分布模型擬合及計算（表4），得到基于保護95%白菜品種的EC10值HC510%為4.52 mg·kg-1，置信區間為 2.02～10.04，EC50值 HC550%為37.68 mg·kg-1，置信區間為24.99～56.79。

3 討論

圖2 不同品種白菜芘脅迫下的劑量-效應關系曲線Figure 2 Dose-response curves of pyrene to Chinese cabbage cultivars

表3 基于生物量（鮮質量）的白菜多環芳烴芘毒性閾值（EC10、EC50）Table 3 Toxicity thresholds of pyrene to cabbage based on biomass（fresh weight）response（EC10、EC50）

圖3 不同白菜品種基于芘劑量-效應毒性閾值的物種敏感性分布頻次曲線Figure 3 Cumulative frequency of SSD of Cd to cabbage varieties based on the ECx

表4 基于SSD擬合的保護95%白菜品種芘生態閾值HC5值Table 4 Ecological hazard concentration（HC5）of pyrene to cabbage based on SSD

多環芳烴在一定范圍內對植物生長具有一定的刺激作用，較高濃度時可抑制植物的生長[24]。張軍[25]通過土培實驗發現，當PAHs含量為1～10 mg·kg-1范圍時，對小麥株高有一定的促進作用，在100 mg·kg-1時，達到顯著抑制作用。洪有為等[26]研究發現隨著菲處理濃度的增高，秋茄幼苗地上部的生長量呈現先升高后降低的趨勢。本實驗結果表明，芘在一定處理濃度范圍（5～45 mg·kg-1）內能夠對不同品種白菜的生長產生不同程度的促進作用，但超過該濃度范圍后對白菜生長產生抑制效果，并且不同白菜品種在芘脅迫下表現出了不同的敏感性，品種JC-60和JQ-65表現出抑制作用，其他9個白菜品種在不同芘處理濃度下表現出不同程度的刺激作用。王海翠等[27]研究表明油菜在不同濃度熒蒽處理下表現為低濃度促進生長，高濃度抑制生長，這與本試驗結果大體一致。有學者提出在低濃度產生促進作用，可能是PAHs與多數植物的生長激素（如生長素和赤霉素）具有類似的環狀結構[28]。然而其他學者認為，低濃度多環芳烴促進植物生長，主要是低濃度多環芳烴可以增加植物的根數，根系活力影響較小，使地上部分生長所需的養分和水分能得到較充足的供應，從而促進植物的生長[29]。在高暴露濃度（405 mg·kg-1）芘處理下11種白菜生長都受到抑制，一方面是多環芳烴能夠影響植物光合作用，通過抑制光系統Ⅱ（PSⅡ）的活動，從而降低光合電子的傳遞速率，進而影響光合作用[30]。尹冬雪等[8]發現隨著芘濃度的升高，葉綠體逐漸受到損傷，擬南芥葉片中葉綠素含量先升高后顯著下降，進而影響光合作用。另一方面，當植物受到逆境脅迫時會產生ROS，ROS會引起植物中蛋白質的分解、DNA損傷、脂肪損傷，從而抑制植物生長[31]。Liu等[32]研究菲脅迫下擬南芥體內H2O2和MDA的含量變化，發現其含量隨著多環芳烴的濃度升高而升高，說明多環芳烴對擬南芥葉片細胞產生了損傷。

劑量-效應關系是指不同劑量的外源化學物與其引起的質效應發生率之間的關系[33]。在環境科學領域，質效應評價指標選擇通常有植物的根伸長、發芽率、生物量（鮮質量、干質量）和遺傳毒性等指標。已有研究發現隨著芘的暴露濃度增加，干質量/鮮質量比值逐漸增加，與干質量相比，以鮮質量為評價終點推導的EC20與EC50值更低，說明鮮質量相比干質量對芘的響應更為敏感[34]。故本文選擇以鮮質量作為芘毒性評價終點。污染物毒性閾值EC10與環境標準制定關系較為密切，在長期暴露的生物學效應中常報道EC50[35]，ECx（x=10，50）的推導則需要環境介質中污染物濃度數據和相關的評價終點指標。本文通過劑量-效應關系曲線推導得出毒性閾值（EC10、EC50），毒性閾值的大小受植物生長介質中污染物濃度與植物評價指標效應強度的影響，低濃度多環芳烴刺激生長，高濃度抑制植物生長，其抑制程度的大小跟多環芳烴對植物的損傷程度有很大關系[36]。Baud-Grasset等[37]研究三環和四環多環芳烴對生菜和燕麥兩種農作物的根伸長抑制情況，得出基于生菜發芽率的EC50值是590 mg·kg-1，基于燕麥發芽率的EC50是1170 mg·kg-1。Sverdrup等[34]通過芘對黑麥草、紅車軸草、白芥根伸長抑制試驗，得出基于芽鮮質量的EC50分別為＞1000 mg·kg-1、380 mg·kg-1、＞1000 mg·kg-1，基于干質量的 EC50值分別為＞1000 mg·kg-1、640 mg·kg-1、＞1000 mg·kg-1。這說明不同種的植物對相同污染物具有不同的抑制效應值，這不僅與受試作物有關，而且跟評價終點也有很大的關系。本試驗結果表明多環芳烴芘對不同白菜品種EC10最大值與最小值相差11.74倍，EC50最大值與最小值相差14.49倍，其原因有可能是不同品種白菜對芘的敏感性不同，對芘的富集能力也不相同，同時植物根際作用對多環芳烴的消解起重要作用。夏雯[38]通過水稻盆栽試驗發現水稻品種對芘消解有顯著影響，而且根際土壤中芘的消解率顯著高于非根際土壤。白菜根系分泌物有可能促進根際微生物種群數量，進而強化根際微生物對芘的降解能力，導致芘在土壤中濃度發生不同程度改變，進而導致EC10與EC50的變化。其具體變化原因有待進一步研究。

生態風險閾值即污染物對生態系統產生影響的臨界值，HCq即保護（100-q）的物種不受影響時所允許的最大劑量濃度。本實驗通過物種敏感性分布模型擬合EC10與EC50，分別得到保護95%白菜品種生態風險閾值HC5值為4.52 mg·kg-1和37.68 mg·kg-1。

4 結論

（1）芘在一定濃度范圍可以促進白菜的生長，但是高濃度時會抑制白菜的生長，并且與白菜品種有很大的關系。

（2）在11種受試白菜中中白50（ZB-50）對芘表現出較強的抗性，并且芘對不同白菜毒性閾值變化差異明顯，EC10在4.14～52.76 mg·kg-1之間變化，EC50在28.35～545.11 mg·kg-1之間變化。

（3）通過物種敏感性分布法得出基于EC10和EC50，保護95%白菜品種的生態風險閾值HC5分別為4.52 mg·kg-1和37.68 mg·kg-1。