風化煤用量下覆膜和AM真菌對玉米生長和土壤微環(huán)境的影響

裘 浪，畢銀麗，張延旭，余海洋

（中國礦業(yè)大學（北京）地球科學與測繪工程學院，煤炭資源與安全開采國家重點實驗室，北京 100083）

我國東部草原煤炭資源開采通常造成土壤結構破壞和土壤沙化加速，使得土壤理化性質退化及生物多樣性下降，主要表現為土壤結構差、有機質低與有效養(yǎng)分少的特性，以致于當地植物生長難、生態(tài)環(huán)境趨于惡化[1]，這也阻礙了礦區(qū)農作物的正常生長和發(fā)育。針對東部草原土層貧瘠和干旱酷寒的問題，提高退化土地生產力和有限降水的利用率是維持東部草原煤礦區(qū)農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑。

叢枝菌根（Arbuscular mycorrhizae，AM）真菌是自然界中普遍存在的一種土壤微生物，其能夠與大多數植物營養(yǎng)根系形成共生關系。大量研究表明，AM真菌可增強宿主植物對土壤水分和N、P、K等養(yǎng)分元素的吸收[2]，增強植物干旱脅迫的耐受能力[3]，同時AM真菌分泌的球囊霉素相關土壤蛋白（Glomalin-relat?ed soil protein，GRSP）能夠促進水分穩(wěn)定的土壤團聚體形成，改善土壤的通透性和持水性，進而促進植物生長[4]。相對于化學肥料投入的經濟效益以及伴隨的環(huán)境負面影響，在農業(yè)生態(tài)系統中運用AM真菌的生態(tài)功能優(yōu)勢，對維持土壤肥力和作物的促生效應具有很大潛力，已被視為有機農業(yè)領域的一種“生物肥料”[5]。

地膜覆蓋技術在我國干旱半干旱地區(qū)得到廣泛運用，主要是因為其明顯的增溫、保墑和增產效果。研究表明，覆膜能夠最大限度地保蓄降雨，減少土壤水分的無效蒸發(fā)，提高作物抗旱性與水分生產效率[6]，但已有研究多集中在比較不同覆膜方式下的農田土壤環(huán)境及產量效應[7]，對覆膜與其他改良劑結合對作物生長發(fā)育和水分利用效率、土壤保水能力和有效養(yǎng)分含量影響的研究并不多見。風化煤作為一類富含腐植酸類物質的廢煤，由于其具有有機質高，吸附、絡合和交換等優(yōu)良特性，對干旱半干旱地區(qū)退化土壤的理化性質具有明顯改良效果，尤其是在保水方面[8]。

AM真菌與宿主植物形成共生體的能力及菌根效應的發(fā)揮與諸多環(huán)境因素密切相關，其中AM真菌種類、土壤環(huán)境以及人類活動等因素都可能影響AM真菌的侵染程度[9-10]，而菌根侵染率大小反映了AM真菌與宿主植物的共生能力，其通常決定了菌根在促進植物生長、養(yǎng)分吸收和抗逆性等方面的能力。覆膜和風化煤用量條件下，接種AM真菌是否還會發(fā)揮其抗旱能力和促進作物養(yǎng)分吸收的生態(tài)效應。土壤酶活性與土壤肥力的形成和轉化具有密切關系，其能夠敏感地反映土壤養(yǎng)分循環(huán)狀況，因而常被作為表征土壤肥力的重要指標之一。但影響土壤酶活性大小的因素復雜多樣，例如土壤養(yǎng)分含量、土壤微生物數量、施肥措施等。目前有關施用風化煤對土壤酶活性大小影響的研究較少，并且已有研究發(fā)現施加風化煤對不同土壤酶活性的響應存在差異[11-12]。基于此，本研究以玉米為供試植物材料，以砂土和風化煤為供試基質，盆栽試驗研究覆薄膜和風化煤用量下接種AM真菌對玉米生長和AM真菌特性、土壤肥力化學與酶活性的影響，旨在為東部草原煤礦區(qū)的作物生境改善提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試玉米品種為“品糯28號”。供試土壤為砂土，來自北京市北沙灘；供試風化煤基質來自陜西省神木縣大柳塔煤礦區(qū)。砂土和風化煤經風干、篩選與蒸汽滅菌（121℃、0.14 MPa、2 h）后裝于塑料盆（上口徑21.5 cm、下內徑14 cm、盆高20 cm）。供試AM真菌為摩西管柄囊霉（Funneliformis mosseae，BGC XJ01），購買于北京農業(yè)科學院，后由中國礦業(yè)大學（北京）微生物復墾實驗室經砂土栽培玉米擴繁培養(yǎng)3個月，菌劑包含感染根段（90%以上）、根外菌絲和真菌孢子（16.1個·g-1）。覆膜材料為市場上的透明保鮮膜。供試土壤基本理化性狀見表1。

表1 供試土壤基本理化性質Table 1 The properties of the tested soil

1.2 試驗設計

試驗采用完全隨機三因素設計，研究因素分別為覆膜方式、供試基質與接種微生物。覆膜方式設2個水平：無覆膜和覆薄膜，其中覆薄膜為玉米幼苗出土后，通過對保鮮膜挖取適量大小的洞使玉米幼苗穿過，同時使保鮮膜鋪滿整個盆栽表面，并用少量土壓實。供試基質設2個水平：砂土基質和砂煤混合基質，其中砂煤混合基質質量比為3∶1。接種微生物設2個水平：接種摩西管柄囊霉（AM）和對照（CK）。試驗共8個處理，每個處理重復3次，共24盆，隨機排列于溫室內。

每盆基質總共5.0 kg，其中砂煤混合基質每盆分別定量稱取3.75 kg砂土和1.25 kg風化煤，并充分拌勻。接種AM真菌處理每盆加50 g AM菌劑，并與供試土樣基質混勻，非接種AM真菌處理每盆加同等質量滅菌AM菌劑。出苗后每盆定植1株玉米，同時向供試土壤中施入NH4NO3、KH2PO4和KNO3混合溶液作基肥，用量分別為 N 120 mg·kg-1、P 30 mg·kg-1、K 150 mg·kg-1。試驗期間通過重量法定期補給水分，使土壤含水量控制在干旱脅迫水平，即供試基質最大持水量的35%。盆栽于2015年5月20日在中國礦業(yè)大學（北京）人工溫室中進行，自然采光，不控溫，定期交換盆栽位置。

1.3 樣品采集與測定方法

植株生長12周后測定玉米株高，隨機選取每株玉米葉片10個點作為葉片SPAD一次重復值。分別收獲玉米地上部分和地下根系，其中留少許植株根系洗凈后用于測定菌根侵染率，其余樣品于80℃烘干，用于測定植株生物量。輕輕抖落附在根系上的土壤作為植株根際土樣，取部分混合均勻土樣測定AM真菌特性（土壤根外菌絲密度、總球囊霉素與易提取球囊霉素）、土壤化學性質（有機碳、全氮、速效磷與速效鉀）與酶活性（蔗糖酶、過氧化氫酶、脲酶與堿性磷酸酶）。試驗期間，記錄每次植株澆水日期和澆水量，用于測定玉米水分利用效率。水分利用效率（WUE）用植物合成每克干物質所需要消耗的水分量來表示，即該數值越低表明水分的利用效率越高，其計算公式為：水分利用效率（mL·g-1）=生育期耗水量（mL）/植株生物量（g）。

植株株高采用直尺直接測量。采用Phillips和Hayman法染色[13]，隨機選取2組15條鮮根段鏡檢測定植株根系的侵染根段數，菌根侵染率計算公式為：菌根侵染率=被侵染根段數/被檢根段數×100%[14]。土壤根外菌絲密度的測定采用網格交叉法[13]。總球囊霉素（Total glomalin，T-GRSP）和易提取球囊霉素（Easily extractable glomalin，EE-GRSP）采用Bradford法測定，檸檬酸鈉浸提，考馬斯亮藍法顯色，紫外可見分光光度計測定樣品吸光度，以每克土壤中蛋白質的毫克數表示球囊霉素相關土壤蛋白含量[15]。

土壤化學性質的測定參考《土壤農化分析》[17]。土壤酶的測定方法參考《土壤酶及其研究方法》[18]，其中蔗糖酶活性的測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法，酶活性以24 h后每克土壤中酶解生成的葡萄糖質量（mg·g-1·24 h-1）表示；過氧化氫酶活性的測定采用高錳酸鉀滴定法，酶活性以20 min后每克土壤消耗的0.02 mol·L-1KMnO4溶液的毫升數（mL·g-1·20 min-1）表示；脲酶活性的測定采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法，酶活性以24 h后每克土壤中釋放出的NH+4-N質量（μg·g-1·24 h-1）表示；磷酸酶活性的測定采用對硝基苯磷酸二鈉比色法，酶活性以每小時每克土壤中釋放出的酚（pNP）質量（μmol·g-1·h-1）表示。

菌根貢獻率（%）=（接菌植株干質量-未接菌植株干質量）/接菌植株干質量×100%。

1.4 數據處理

采用SAS 8.0統計軟件進行方差分析（ANOVA），最小顯著差數法（LSD，α=0.05）進行多重比較。Excel 2010軟件處理數據并作圖。

2 結果與分析

2.1 不同處理對玉米根系侵染、土壤根外菌絲密度與球囊霉素的影響

非接種AM真菌的對照處理玉米根系未發(fā)現被菌絲侵染（表2），而接種AM真菌處理的玉米根系侵染率和土壤根外菌絲密度在砂煤混合基質下均高于砂土基質，分別提高了3.5%～6.6%和3.1%～34.3%，但無顯著差異。同一覆膜方式下，砂煤混合基質下的接種AM真菌和CK處理的土壤T-GRSP和EE-GRSP含量均顯著高于砂土基質下的兩個處理（P＜0.05），表明施加風化煤有機物提高了土壤中GRSP含量，其中與砂土基質相比，砂煤混合基質下的土壤T-GRSP含量在無覆膜和覆薄膜下分別提高了80.0%～89.3%和81.4%～106.5%（P＜0.05），土壤EE-GRSP含量在無覆膜和覆薄膜下分別提高了55.0%～76.7%和71.8%～73.3%（P＜0.05）。同一覆膜和供試土壤基質下，接種AM真菌相比CK處理提高了土壤T-GRSP和EEGRSP含量，其中兩個處理間的土壤T-GRSP在無覆膜+砂煤混合基質和覆薄膜+砂土基質下有顯著差異，以及土壤EE-GRSP在覆薄膜+砂煤混合基質下有顯著差異（P＜0.05）。

2.2 不同處理對玉米生長特性的影響

同一覆膜和供試土壤基質下，接種AM真菌相比CK處理顯著提高了玉米株高、生物量與葉片SPAD值（除無覆膜+砂土基質外），分別提高了9.0%～42.9%、36.5%～157.1%與4.7%～29.5%（P＜0.05）（表3）。同時砂土基質下接菌植物生物量的菌根貢獻率要高于砂煤混合基質，說明施加風化煤降低了接菌植物生長對菌根的依賴性。覆薄膜下，砂煤混合基質下CK處理的玉米株高和生物量要高于砂土基質下接種AM真菌處理，這可能與風化煤的保水特性有關。干旱脅迫下，覆薄膜相比無覆膜處理提高了玉米平均株高、生物量與葉片SPAD值，但無顯著差異。

2.3 不同處理對玉米水分利用效率的影響

覆薄膜相比無覆膜處理顯著降低了玉米生育期平均耗水量（圖1），而砂煤混合基質處理的玉米生育期平均耗水量相比砂土基質處理顯著提高了46.4%（P＜0.05）。同一覆膜和供土壤基質下，接種AM真菌相比CK處理提高玉米生育期耗水量，其中無覆膜下，接種AM真菌處理的生育期耗水量相比CK處理在砂煤混合基質下顯著提高了48.8%（P＜0.05）。方差分析結果表明，玉米水分利用效率受到覆膜方式、供試基質與接種微生物及其各因素二者及三者之間交互的顯著影響（P＜0.05）（表3）。覆薄膜處理的玉米平均水分利用效率相比無覆膜處理顯著提高了27.8%（P＜0.05），其中無覆膜下，砂煤混合基質的接種AM真菌和CK處理的水分利用效率分別顯著高于砂土基質下的相應處理，分別提高了58.8%和19.2%（P＜0.05）；而覆薄膜下，接種AM真菌處理的水分利用效率在砂煤混合基質與砂土基質間無顯著差異。

表2 不同土壤基質和覆膜下接種AM真菌對玉米根系侵染、土壤根外菌絲密度與球囊霉素的影響Table 2 Effect of AM fungi inoculation on mycorrhizal colonization，soil external hyphal length and glomalin under soil substrate types and film mulching patterns

表3 不同土壤基質和覆膜下接種AM真菌對玉米生長特性的影響Table 3 Effect of AM fungi inoculation on maize growth under soil substrate types and film mulching patterns

圖1 不同土壤基質和覆膜下接種AM真菌對玉米生育期耗水量的影響Figure 1 Effect of AM fungi inoculation on water consumption during whole growth period of maize under soil substrate types and film mulching patterns

2.4 不同處理對玉米根際土壤有機碳和養(yǎng)分的影響

方差分析結果表明，供試砂煤混合基質顯著提高了玉米根際土壤有機碳和全氮含量（表4）。同一覆膜和供試土壤基質下，接種AM真菌的根際土壤有機碳含量高于CK處理，但無顯著差異；但卻顯著降低了根際土壤全氮（除無覆膜+砂土基質外）和速效鉀（除無覆膜+砂煤混合基質外）含量，其中土壤全氮含量分別在砂土基質和砂煤混合基質下降低了40.0%～57.1%和14.3%～23.8%（P＜0.05），土壤速效鉀含量分別在砂土基質和砂煤混合基質下降低了27.5%～41.2%和11.9%～16.3%（P＜0.05），這主要得益于土壤中大量根外菌絲，其可有效地吸收根系周圍的土壤營養(yǎng)元素。覆薄膜+砂煤混合基質下接種AM真菌的根際土壤速效磷含量相比CK處理顯著降低了28.5%（P＜0.05）。此外，覆薄膜相比無覆膜處理顯著降低了土壤速效鉀平均含量（P＜0.05）。

2.5 不同處理對玉米根際土壤酶活性的影響

不同處理對玉米根際土壤4種酶活性的影響各不相同（表5）。土壤蔗糖酶一般參與土壤有機質的代謝，促進蔗糖轉化為葡萄糖和果糖。無覆膜下，砂煤混合基質下接種AM真菌和CK處理的根際土壤蔗糖酶活性相比砂土基質下相應處理分別顯著提高了59.8%和46.8%（P＜0.05）。土壤過氧化氫酶可將土壤中多余的過氧化氫分解成水和氧，從而抑制其對植物的毒性，脲酶可催化尿素和有機氮轉化為銨態(tài)氮，從而有利于植物吸收。同一覆膜和供試土壤基質下，接種AM真菌相比CK處理顯著提高了土壤過氧化氫酶和脲酶活性，其中覆薄膜下，砂煤混合基質下的接種AM真菌和CK處理的土壤過氧化氫酶活性顯著高于砂土基質下相應處理（P＜0.05），而土壤脲酶活性無明顯差異。土壤堿性磷酸酶可以將土壤中有機磷酯和磷酸水解轉化為無機態(tài)磷。覆薄膜下，砂煤混合基質下的接種AM真菌和CK處理的土壤堿性磷酸酶活性顯著高于砂土基質下相應處理，分別提高了57.8%和87.5%（P＜0.05），而無覆膜下兩個供試土壤基質間的處理無顯著差異。此外，覆薄膜相比無覆膜處理顯著提高了玉米根際土壤平均蔗糖酶、脲酶與堿性磷酸酶活性，卻顯著降低了土壤過氧化氫酶活性（P＜0.05）。

表4 不同土壤基質和覆膜下接種AM真菌對玉米根際土壤有機碳和養(yǎng)分的影響Table 4 Effect of AM fungi inoculation on rhizosphere soil SOC and nutrient content under soil substrate types and film mulching patterns

表5 不同土壤基質和覆膜下接種AM真菌對玉米根際土壤酶活性的影響Table 5 Effect of AM fungi inoculation on rhizosphere soil enzyme activities under soil substrate types and film mulching patterns

2.6 相關性分析

相關分析結果表明（表6），砂土基質下的植物株高、生物量、土壤有機碳和脲酶均與菌根侵染率和土壤根外菌絲密度呈顯著正相關（P＜0.01），而植物水分利用效率、土壤全氮、速效磷、速效鉀均與菌根侵染率和土壤根外菌絲密度呈顯著負相關（P＜0.01），表明AM真菌的侵染率強度及其根外菌絲能夠顯著影響土壤養(yǎng)分轉運與植物水分的利用效率；同時，植物生物量和葉片SPAD值均與土壤T-GRSP（P＜0.01）和EEGRSP（P＜0.05）呈顯著正相關。

砂煤混合基質下的植物生物量、葉片SPAD值、過氧化氫酶和脲酶均與菌根侵染率和土壤根外菌絲密度呈顯著正相關（P＜0.01）；但其與砂土基質不同的是，砂煤混合基質下的土壤有機碳、速效磷、速效鉀并不與菌根侵染率和土壤根外菌絲密度呈顯著相關性。此外，植物水分利用效率與土壤根外菌絲密度呈顯著負相關（P＜0.05），相關系數為-0.639。植物生物量、葉片SPAD值和脲酶均與土壤T-GRSP和EE-GRSP呈顯著正相關（P＜0.05）；相反，土壤全氮與二者呈顯著負相關（P＜0.05），相關系數分別為-0.690和-0.657。

3 討論

東部草原煤炭資源開采造成的土壤結構破壞與養(yǎng)分流失，給礦區(qū)農業(yè)帶來了一定損失。通過菌根微生物技術緩解礦區(qū)土壤貧瘠與水分缺乏問題，是維持礦區(qū)農業(yè)生態(tài)系統發(fā)展的重要途徑之一。菌根侵染是根系菌根化的重要指標，由于菌根真菌與宿主植物根系共生的媒介是土壤，因此諸如土壤類型、養(yǎng)分高低或含水量大小都影響著菌根真菌對宿主植物的侵染效果[19]。研究表明，在一定范圍內AM真菌的共生能力會隨著有機質含量的升高而增強，但長期高有機質土壤環(huán)境則會降低AM真菌對宿主植物根系的侵染率和叢枝著生率或侵入點數[20]。本研究發(fā)現，砂煤混合基質的土壤有機質含量明顯高于砂土基質，但接種AM真菌處理的玉米根系侵染率在兩種基質間無明顯差異，說明短期內施加風化煤并不能影響AM真菌對宿主植物的侵染程度。但砂煤混合基質明顯提高了土壤T-GRSP和EE-GRSP含量（P＜0.05）。球囊霉素相關土壤蛋白（GRSP）主要是由AM真菌菌絲和孢子分泌的一類糖蛋白，是土壤有機碳庫的重要組成部分。但隨著對GRSP的深入研究，研究者們發(fā)現GRSP并不是一種典型的糖蛋白，它也可能是一種土壤中的腐植酸，并且其提取過程非專一性，而風化煤富含腐植酸[21]，這就可能導致施砂煤混合基質的GRSP提取含量要高于砂土基質。施加風化煤能夠提高土壤GRSP含量，在一定程度上對促進礦區(qū)土壤大團聚體形成、改善退化土壤結構和土壤水分特性具有重要作用。

表6 不同處理下玉米生長和根際土壤指標與AM真菌特性之間的皮爾遜相關分析（n=12）Table 6 Pearson′s correlation coefficients for various parameters of maize growth，rhizosphere soil property and AM fungi characteristics among all treatments（n=12）

宿主植物保持較高的菌根侵染率可有效促進植物根系吸收更多的養(yǎng)分和水分，這主要是通過根外菌絲運輸遠離宿主植物根系周圍的礦質養(yǎng)分和水分，同時菌絲分泌的土壤球囊霉素具有“超級膠水”的作用，其能夠促進土壤顆粒黏附成大聚合體，進而形成穩(wěn)定的土壤大團聚體，同時水穩(wěn)性團聚體的數量和分布狀況會影響植物對土壤水分的利用性[22]。本研究中砂煤混合基質下的玉米生育期耗水量總體高于砂土基質下，但其植株制造每克干物質的耗水量卻顯著低于砂土基質下（P＜0.05），說明施加風化煤改善了土壤水分含量，提高了干旱脅迫下的土壤保水能力。玉米水分利用效率得到顯著改善，主要在于風化煤松疏多孔，具有較強的吸附性和吸水性，調節(jié)了土壤水分含量。這與陳伏生等[23]的研究結果一致，其研究發(fā)現相比土壤水分充足，在土壤水分輕微干旱時施加風化煤可提高土壤通透性，有利于植物吸收水分和養(yǎng)分及根系呼吸。

風化煤由于含氧量高、發(fā)熱量低，并且具有吸附、絡合和交換等性能，已被廣泛作為一種土壤改良劑[24]。由于風化煤富含有機質，使得砂煤混合基質下的土壤有機碳含量明顯高于砂土基質，同時提高有機質含量也可有效提高土壤全氮含量。本研究中，同一覆膜和供試土壤基質下，接種AM真菌降低了玉米根際土壤全氮、速效磷與速效鉀含量。袁麗環(huán)等[25]的研究發(fā)現，接種AM真菌對根際磷酸酶有刺激和分泌作用，能夠加速土壤全磷礦化，促使根際土壤速效磷富集。這與本試驗研究結果不一致，可能是因為本試驗供試土壤基質肥力不足、含磷量匱乏，玉米根系周圍有限的磷養(yǎng)分被植物地上部分所吸收利用。一般來說，當AM真菌處于土壤養(yǎng)分貧瘠環(huán)境中時，其能夠明顯促進植物吸收N、P、K等營養(yǎng)元素。此外，覆膜能夠改善土壤水溫條件、增強土壤微生物活性，從而能夠增強植物對土壤中速效養(yǎng)分的利用效率[26]。本研究也發(fā)現覆薄膜促進了玉米對根際土壤速效養(yǎng)分的吸收，并且對土壤速效鉀含量有顯著影響（P＜0.05），表明這對東部草原礦區(qū)因氣候干旱寒冷逆境下的植物生長和發(fā)育具有促進作用。

土壤酶活性作為土壤肥力的一個潛在指標，在土壤養(yǎng)分的循環(huán)代謝過程中起著重要作用。一般來說，影響土壤酶活性的因素很多，例如土壤微生物數量、理化性質、施肥措施等，其中土壤有機質的存在狀況和含量會與土壤酶活性大小有關[27]。本研究中，與砂土基質相比，砂煤混合基質總體表現為提高了玉米根際土壤酶活性。干旱脅迫環(huán)境下，施加風化煤一定程度上改善了土壤水分狀況并加快了土壤養(yǎng)分的轉運，從而刺激植物根系或其他微生物分泌了一定量的土壤酶。方差分析結果表明，供試基質與接種AM真菌二者互作對玉米根際土壤酶活性無顯著影響，但接種AM真菌明顯提高了根際土壤蔗糖酶（除覆薄膜外）、過氧化氫酶、脲酶與堿性磷酸酶活性，這與賀學禮等[28]的研究結果一致。研究表明，AM-植物共生關系能夠提高宿主植物的光合作用能力，從而將多余的碳水化合物由地上轉移到土壤中，增強植物根系或土壤中微生物分泌酶的能力[29]。同時，土壤酶活性與土壤有效養(yǎng)分含量高低也有直接影響，而接種AM真菌能夠提供更多的有效養(yǎng)分供給土壤中的微生物，這有利于刺激土壤微生物釋放更多的酶[30-31]。

4 結論

（1）砂煤混合基質下，AM真菌與玉米根系形成良好的共生體促進了玉米和土壤根外菌絲生長，提高了植物生物量和葉片SPAD值，同時改善了植物水分利用效率；尤其是在覆薄膜條件下，接種AM真菌對干旱脅迫下植物生長的促進效果最好。

（2）與砂土基質相比，砂煤混合基質提高了玉米根際土壤有機碳和全氮含量，促進了土壤速效養(yǎng)分轉運和土壤GRSP含量增加，同時提高了根際土壤酶活性，說明施加風化煤可提高土壤基質的肥力和穩(wěn)定性。

（3）施加風化煤下接種AM真菌與覆薄膜聯合對水分脅迫下植物生長發(fā)育、土壤養(yǎng)分轉運和酶活性提高具有重要促進作用，這有利于緩解干旱半干旱礦區(qū)植物或作物生長面臨的土壤養(yǎng)分貧瘠和水分缺乏狀況。