克雷伯氏菌活細胞和死細胞對水中Pb（Ⅱ）的去除性能

劉樹麗，段正洋，徐龍乾，徐曉軍，宋淑敏，張夢嬌

（昆明理工大學環境科學與工程學院，昆明 650500）

鉛可以應用于很多領域，如鉛酸電池、建筑材料、印刷、染料和礦物燃料等[1-2]。然而，鉛是一種毒性很強的重金屬，環境中過量的鉛暴露能夠破壞生態系統。鉛不能被微生物降解，含鉛廢水如未有效處理，極易造成鉛的轉移和積累，即使低濃度鉛也會對人體的神經、消化和腎臟等系統以及環境造成危害[3]。將鉛從水溶液中有效分離，不僅能夠回收利用鉛資源，還能保護人類和生態系統的安全。目前處理含鉛廢水的方法有化學沉淀、電化學、氧化還原、離子交換、溶液萃取、絮凝、吸附和生物吸附等。其中生物吸附法具有去除率高、處理成本低、生物吸附材料來源廣泛、吸附劑容易再生和無二次污染等優點，因此在重金屬處理方面受到廣泛的關注。

生物吸附法是通過某些生物體本身及其胞外分泌物吸附水溶液中的金屬離子，使固相和液相進行分離從而去除水中金屬離子的方法[4]。近年來，細菌、真菌、藻類等微生物已被廣泛用于水中重金屬的處理。目前，微生物作為吸附劑去除鉛的研究多集中在微生物的篩選分離、微生物及其胞外分泌物的吸附能力、微生物的預處理和改性、吸附模型（吸附等溫線和吸附動力學）、吸附機理以及其潛在的應用價值。盡管自然界中存在各種各樣的微生物，但是篩選出具有耐受性及高效結合重金屬能力的微生物是處理含重金屬廢水的關鍵步驟。許多微生物都能去除Pb（Ⅱ），細 菌 中 的 Bacillus sp.、Corynebacterium glutamicum、Pseudomonas aeruginosa、Enterobacter sp.和 Streptomy?ces rimosus等，真菌中的Saccharomyces cerevisiae、Peni?cillium sp.和Aspergillus sp.等，以及藻類中的褐藻（Pa?dina tetrastomatica等）、綠藻（Cladophora glomerata等）和紅藻（Gracilaria corticata等）[5]。除此之外，一些微生物的胞外分泌物（EPS）也能有效去除水中的鉛，如Bacillus sp.[6]、Shewanella oneidensis[7]和 Aspergillus fu?migatus[8]等微生物產生的分泌物就能夠吸附鉛。微生物對重金屬吸附能力的研究，主要是對其影響因素如pH值、吸附劑用量、重金屬濃度、溫度、吸附等溫線及吸附動力學等方面，以便得到最佳的吸附條件。微生物細胞的細胞壁組成物質中，含有羥基、羧基、氨基和磷酸基等基團，這些基團能通過離子交換、絡合、靜電吸引、吸附和螯合等作用結合重金屬離子[9]。由于微生物所含有的官能團的數量有限，為了提高其吸附能力，近年來，化學和基因改性微生物的方法經常被用于提高微生物的生物吸附能力。Zhang等[10]制備的納米-ZnO酵母菌可以明顯提高水溶液中鉛的去除能力；Montazer-Rahmatia等[11]使用化學試劑甲醛（FA）、戊二醛（GA）、聚乙烯亞胺（PEI）、CaCl2和HCl處理褐藻，提高了其吸附能力的穩定性；楊婷[12]利用基因工程技術，將枯草芽孢桿菌的抗砷基因arsR通過載體質粒轉至大腸桿菌內，誘導合成砷調節蛋白ArsR，用于砷的富集和去除。

通過化學或基因改性的方法能夠提高微生物去除重金屬的能力，但許多學者的研究也表明不同的微生物其死細胞或活細胞的吸附能力不同。在多數的研究中，微生物的死細胞比活細胞表現出更強的吸附 能 力 。 Velásquez等[13]研 究 了 Bacillus sphaericus OT4b31和Ⅳ（4）10處于生長中的活細胞和經過處理的死細胞對Cr（Ⅵ）吸附，死菌體是經過pH為2.5的酸化去離子水（H2SO4）處理后，再經80℃烘干后得到，研究結果表明，Bacillus sphaericus OT4b31和Ⅳ（4）10的活細胞對Cr（Ⅵ）的去除率分別為25%和32%，而相應的死細胞對金屬Cr（Ⅵ）的去除率分別為44.5%和45%，死細胞的生物吸附能力高于活細胞，可能是由于經過處理的死細胞暴露出了更多的結合位點。Huang等[14]研究了Bacillus cereus RC-1培養后離心獲得的活細胞和經過121℃、20 min處理的死細胞對Cd（Ⅱ）的吸附能力，結果為死細胞的吸附能力高于活細胞，且FTIR分析表明經過高溫處理的Bacillus cere?us RC-1的死細胞暴露出更多的-COOH，從而提高了吸附量。Du等[15]使用Pseudomonas sp.strain DY1培養后獲得的活菌體和高溫處理的死菌體（100℃30 min）吸附水溶液中金屬絡合染料酸性黑172，實驗結果也表現出死菌體的吸附能力高于活菌體，高溫處理的死菌體具有更強的吸附能力，是由于死細胞具有更高的細胞滲透性且細胞內蛋白質變性后氨基基團起到了重要的作用。但有些微生物經過滅活處理后，其死細胞的去除能力低于活細胞。Sayyadi等[16]研究Saccharomyces carlsbergensis PTCC 5051去除Cd（Ⅱ）和Cs（Ⅰ）時發現，經過高溫滅菌處理，含有NaN3或2，4二硝基酚的氨丁三醇緩沖劑處理的Saccharomyces carlsbergensis PTCC 5051的死細胞的生物吸附能力明顯低于活細胞。Malkoc等[17]研究Variovorax paradoxus和Arthrobacter viscosus對Zn（Ⅱ）的生物吸附能力時，發現Variovorax paradoxus的活細胞的吸附能力高于死細胞，而Arthrobacter viscosus的活細胞的吸附能力低于死細胞。對于不同的微生物，經過一些方法處理后得到的死細胞（例如高溫處理），相對于活細胞，其吸附能力不同且吸附能力差異的機理也不同。Huang等[14]和Du等[15]的研究表明死細胞的吸附效果高于活細胞，但是兩者死細胞吸附能力提高的機理是不同的。因此，本研究選用實驗室篩選出的克雷伯氏菌作為目標菌種，研究其死細胞和活細胞對鉛的去除能力。

克雷伯氏菌普遍存在于土壤、水體、谷物等自然環境以及生物體的消化、呼吸系統中。克雷伯氏菌屬于革蘭氏陰性菌，根據近幾年相關研究與報道，其在污水處理及重金屬治理方面具有很強的應用潛力。Mu?oz等[18]研究了從污水處理廠中分離出的克雷伯氏菌3S1對水中Pb（Ⅱ）的吸附能力；信欣等[19]研究了克雷伯氏菌的胞外分泌物去除水中的Pb（Ⅱ）；Yang等[20]利用克雷伯氏菌的胞外分泌物同時去除水中的Cu（Ⅱ）和Zn（Ⅱ）。克雷伯氏菌還被用于水中有機物的降解[21]。但是對克雷伯氏菌活細胞和通過高溫處理后的死細胞吸附重金屬能力的對比研究鮮見報道。所有對于微生物作為生物吸附劑的研究都是為實際應用作指導，因此選擇安全、高效的微生物是關鍵的部分，若選用的微生物具有致病性等則會造成處理重金屬以后產生二次污染等環境問題。本研究中選用的克雷伯氏菌，是一種具有致病性的微生物。克雷伯氏菌主要有肺炎克雷伯氏菌、臭鼻克雷伯氏菌和鼻硬結克雷伯氏菌。克雷伯氏菌有較高的發病率和死亡率，該菌能夠導致醫院內新生兒呼吸道和泌尿系統的感染，還會引發菌血病和燒傷患者的感染。尤其是肺炎克雷伯氏菌引起的肺炎，此菌存在于人體腸道、呼吸道，可引起支氣管炎、肺炎，泌尿系和創傷感染，甚至敗血癥、腦膜炎、腹膜炎等。對克雷伯氏菌活菌和死菌的吸附能力進行研究，如果活菌吸附能力高于死菌，可以從理論上分析兩者存在差異的原因；若死菌的吸附能力強于活菌，本研究不僅可以從理論上闡述死細胞和活細胞吸附能力差異的原理，更重要的是，具有致病性的克雷伯氏菌經過高溫處理后失去活性，其對環境和人體都是一種安全的生物吸附劑，可以安全的應用于實際的生產應用中。

本文使用從云南某礦山廢水中篩選得到的克雷伯氏菌，將發酵培養后直接離心收集的菌體作為活細胞吸附劑，發酵培養結束后再高溫處理收集的菌體作為死細胞吸附劑，在不同影響因素條件下（pH值、吸附劑用量、反應時間和初始鉛濃度），對比了活細胞和死細胞對水中鉛的吸附能力。根據活細胞和死細胞的吸附動力學、吸附等溫線、掃描電子顯微鏡（SEM）分析、比表面積分析、Zeta電位、傅里葉紅外光譜（FT?IR）和X射線光電子能譜（XPS）分析，闡述了克雷伯氏菌活細胞和死細胞對鉛去除性能的差異，為生物吸附劑去除重金屬的應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗藥劑和儀器

實驗藥劑：蔗糖，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，硫酸鎂，氯化鈉，尿素，氫氧化鈉，硫酸，硝酸鉛。所用藥品均為分析純。

實驗儀器：分析天平（JA3003C，上海亨方科學儀器有限公司），pH計（PHSJ-5，上海雷磁儀器廠），恒溫培養振蕩器（SPH-1112D，上海世平實驗設備有限公司），高速冷凍離心機（GL-21M，賽特湘儀離心機儀器有限公司），立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-30SII，上海博訊醫療生物儀器股份有限公司），智能真空干燥箱（DZF，上海丙林電子科技有限公司），原子吸收分光光度計（TAS-990AFG，北京普析通用儀器有限責任公司），傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet iS5N，賽默飛世爾科技（中國）有限公司），Zeta電位分析儀（馬爾文nano ZS90，艾克賽普精密測控有限公司），掃描電子顯微鏡（JSM-7500F，上海百賀儀器科技有限公司），比表面積分析儀（JW-BK132F，北京精微高博科學技術有限公司），X射線光電子能譜分析儀（X′Pert?Powder，馬爾文帕納科公司）。

1.2 菌種來源

實驗所用菌株取自云南某礦山廢水，使用常規的稀釋涂布和分離劃線法獲得的耐鉛細菌，經16S rDNA序列分析鑒定為克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）。

1.3 實驗用培養基

菌株活化培養基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1.0 L，pH=7.0～7.2。

菌株發酵培養基：蔗糖15.0 g，磷酸二氫鉀2.0 g，磷酸氫二鉀5.0 g，硫酸鎂0.2 g，氯化鈉0.1 g，尿素3.3 g，蒸餾水1.0 L，pH=6.0。

1.4 克雷伯氏菌活細胞和死細胞的制備

先將克雷伯氏菌在活化培養基上培養24 h，按3%的接種量接種于液體培養基中，在恒溫培養振蕩器中28℃、120 r·min-1的條件下培養至對數期。將其中一部分發酵液進行121℃、30 min高溫滅菌處理，然后離心（10 000 r·min-1、4 ℃）10 min后收集死菌體，作為死細胞吸附劑，命名為DC；另一部分菌體懸液直接使用離心機離心（10 000 r·min-1、4℃）10 min后，收集的菌體直接作為活細胞吸附劑，命名為LC。上述死細胞和活細胞吸附劑在離心后均需再用無菌水洗滌2～3次后再離心收集，以去除表面殘留的培養基。收集到的死細胞和活細胞在80℃真空干燥箱中烘干后保存待用。

1.5 吸附試驗

將100 mL不同初始濃度的鉛溶液加入到250 mL錐形瓶中，分別加入一定質量的DC吸附劑和LC吸附劑，使用1 mol·L-1的HNO3和 1 mol·L-1的NaOH調節溶液的pH，放置于恒溫培養振蕩器中，混合液在特定的轉速（150 r·min-1）、特定的溫度條件下反應一定時間。在反應達到平衡后，使用離心機，在10 000 r·min-1、4℃的條件下離心10 min，將上清液使用原子吸收分光光度計測定鉛離子濃度，并計算鉛的去除率及DC和LC對鉛的單位質量吸附量，計算公式如下：

式中：R表示DC和LC對Pb（Ⅱ）的去除率，%；qe為DC和LC對Pb（Ⅱ）的單位質量（干質量）吸附量，mg·g-1；C0為初始Pb（Ⅱ）濃度，mg·L-1；Ce為吸附后溶液中剩余的Pb（Ⅱ）濃度，mg·L-1；V為實驗使用的Pb（Ⅱ）溶液的體積，L；m為DC和LC的質量（干質量），g。所有實驗均進行3次，最后結果取平均值。

1.6 特征分析

Zeta電位測定：分別稱一定量的DC和LC溶于水中，使其質量濃度均為0.2 g·L-1（干質量），使用1 mol·L-1的H2SO4和1 mol·L-1的NaOH調節溶液的pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0，溶液混合均勻后，測定各個pH值下的Zeta電位。

SEM表征：使用日本JSM-7500F場發射電子顯微鏡對LC和DC的表面形態結構進行觀察，實驗在20 kV的電壓下進行。

LC和DC的比表面積和孔徑使用比表面積分析儀進行測定，比表面積使用N2的吸附-解吸曲線進行計算，孔徑使用Barrett-Joyner-Halenda（BJH）模型進行測試。

FTIR表征：DC和LC兩種吸附劑及DC吸附Pb（Ⅱ）后的樣品（后面標記為DC-Pb）中分別加入KBr，混合均勻后研磨，直至混合物粉末粘在瑪瑙研缽的壁上，然后，將混合物放入下壓芯中進行壓片，壓片結束后，取出制作好的壓片放入到紅外光譜儀中測繪其紅外光譜。

XPS分析：在室溫下使用Al Kα X射線（hν=1 486.6 eV）單色束激發出光電子，所得到的結合能對應的峰參考C1s在結合能為284.8 eV的峰。

2 結果與討論

2.1 DC和LC的表征分析

2.1.1 SEM分析

SEM分析是一種用于分析生物吸附劑表面形態的有用的技術方法。從圖1可以看出未經處理的克雷伯氏菌LC（圖1a）和經過高溫滅菌的克雷伯氏菌DC（圖1b）的表面形態存在很大的差異。LC成桿狀，細胞表面平滑、規則；DC的細胞完整性被破壞，細胞表面粗糙不規則并且具有大量的孔隙結構，這些孔隙的形成有利于DC對水溶液中Pb（Ⅱ）的吸附。

圖1 LC和DC在SEM下的形貌特征Figure 1 SEM morphology of LC and DC

2.1.2 比表面積分析

DC和LC的N2吸附-解吸等溫曲線在-196.15℃條件下進行，結果見圖2。根據國際純粹與應用化學聯合會（IUPAC）分類，DC和LC的N2吸附-解吸曲線符合類型Ⅳ等溫曲線，表明DC和LC的孔隙結構主要是微孔和介孔[22]。DC和LC的比表面積分別為12.810 m2·g-1和 2.728 m2·g-1，平均孔徑分別為 10.150 nm和8.466 nm。因此，經過滅菌處理的DC的比表面積和孔徑均明顯大于LC，表明DC在吸附過程中能夠提供更大的吸附表面，從而有利于對Pb（Ⅱ）的去除。該結果與SEM的結果相一致。

2.2 吸附試驗

2.2.1 pH對吸附效果的影響

在100 mL 50 mg·L-1的Pb（Ⅱ）溶液中，分別加入0.02 g的DC吸附劑和LC吸附劑，并調節溶液pH值分別為1.0、2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和 6.0，混合液置于30℃恒溫培養振蕩器中振蕩120 min。實驗結果見圖3a。

圖2 DC和LC的N2吸附-解吸曲線Figure 2 N2adsorption-desorption isotherms of DC and LC

圖3 pH對DC和LC吸附Pb（Ⅱ）的影響（a）及DC和LC表面的Zeta電位（b）Figure 3 Effect of pH on the adsorption of DC and LC for Pb（Ⅱ）（a），and Zeta potential of DC and LC（b）

從圖3a可知，pH值對DC和LC吸附Pb（Ⅱ）有很大的影響。當pH值從2.0增加到5.5，DC和LC對Pb（Ⅱ）的吸附量分別從10.78 mg·g-1和8.91 mg·g-1，增加到131.86 mg·g-1和104.83 mg·g-1。pH值的影響表明DC和LC對Pb（Ⅱ）的吸附主要是表面絡合作用。當pH值低于3.0時，DC和LC兩種吸附劑表面的官能團被質子化，大量活性位點被H+占據，H+和帶正電的Pb（Ⅱ）對吸附位點存在競爭，從而降低了吸附劑對Pb（Ⅱ）的吸附[23]。當pH值從3.0增大到6.0時，H+離開吸附劑表面，吸附劑表面官能團的質子化作用逐漸降低，從而更有利于吸附劑表面官能團對Pb（Ⅱ）的吸附。在pH值為3.0～6.0時，DC對Pb（Ⅱ）的吸附量高于LC，從圖3b中DC和LC表面的Zeta電位分析可知，在此pH值范圍內，DC比LC帶有更多的負電荷，從而加強了DC對Pb（Ⅱ）的吸附。

Reddy等[24]和He等[25]分別研究三維多孔尖晶石鐵氧體和β-環糊精結合石灰去除水溶液中的Pb2+時報道了水溶液中鉛的存在形態主要有Pb2+、Pb（OH）+、Pb（OH）2、Pb（、Pb（OH，各存在形態所占百分比隨溶液pH變化的關系如圖4所示。從圖4可知，當pH值大于6.0時，有Pb（OH）+沉淀產生。在本研究的實驗條件下，經過多次重復實驗，當pH值大于6.0后，已經有明顯的沉淀形成，難以判斷是沉淀作用還是吸附作用，因此后續實驗均在pH 5.5的條件下進行。

為了對比DC和LC兩種吸附劑在不同pH值條件下其表面所帶電荷的情況，采用Zeta電位進行分析。膠體粒子分散在溶液中，其表面電荷產生了Zeta電位，它是描述膠粒表面電荷性質的一個物理量，由于DC和LC表面存在大量的官能團，當這兩種吸附劑在溶液中分散時，細胞表面的官能團發生電離，形成雙電層，進而產生Zeta電位[26]。Zeta電位可以研究吸附劑表面所帶電荷量及電性隨pH值的變化，還可以對比兩種吸附劑表面電荷量和電性的差異以分析吸附劑在吸附過程中吸附行為的差異。

圖4 Pb2+的形態分布Figure 4 Speciation of Pb2+

在不同的pH值條件下，DC和LC的表面電荷變化見圖3b。隨著pH值的增加，DC和LC的Zeta電位降低，這是由于隨著pH值的增加，兩種吸附劑表面官能團的質子化作用減弱。DC和LC的等電點分別約為2.3和3.1，DC的等電點低于LC，說明DC對正價的金屬離子具有更寬的吸附pH范圍。在pH低于2.3時，DC表面帶正電荷，會降低DC表面官能團和Pb（Ⅱ）之間的靜電吸引作用從而使吸附效果受到影響。在pH值大于2.3后，DC比LC帶有更多的負電荷，可能是因為經過高溫滅菌處理后，DC表面暴露出更多的官能團，能夠增加DC表面的電負性，從而有效提高DC對Pb（Ⅱ）的吸附量。該結果與pH值對吸附量的影響結果相一致。

2.2.2 吸附劑用量對吸附效果的影響

在一系列100 mL的50 mg·L-1的Pb（Ⅱ）溶液中，分別加入吸附劑DC和LC，使其質量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 g·L-1（干質量），調節溶液pH=5.5，在30℃的條件下振蕩120 min。DC和LC對Pb（Ⅱ）的去除率和吸附量結果如圖5所示。隨著DC和LC用量從0.1 g·L-1增加到0.8 g·L-1，DC和LC對Pb（Ⅱ）的去除率分別從32.45%和24.05%增加到97.31%和72.47%，這是因為吸附位點的數量隨著吸附劑添加量的增加而增加，從而使去除率提高。從圖5可知，DC和LC的用量增加到0.5 g·L-1后，DC和LC對溶液中Pb（Ⅱ）的去除率沒有明顯的增加，這可能是由于溶液中Pb（Ⅱ）的含量較低。與此同時，DC和LC對Pb（Ⅱ）的吸附量隨著吸附劑用量的增加而降低，這可能是吸附劑用量增加時造成了吸附劑的聚集，從而降低了有效的吸附面積，在吸附位點之間產生了干擾；當吸附劑用量較高時，吸附劑表面可能會產生一種“屏蔽效應”，從而降低了對Pb（Ⅱ）的吸附[27]。為了避免這種“屏蔽效應”，以及考慮使用成本和在相同條件下比較兩種吸附劑對Pb（Ⅱ）的去除效果，后續實驗選擇DC和LC的用量均為0.2 g·L-1。從實驗結果可知，在不同的吸附劑用量條件下，DC對Pb（Ⅱ）的吸附效果明顯優于LC。

圖5 DC和LC用量對吸附Pb（Ⅱ）的影響Figure 5 Effect of DC and LC dosage on the adsorption of Pb（Ⅱ）

2.2.3 反應時間的影響和吸附動力學

吸附過程的動力學研究主要是用來描述吸附劑對吸附質的吸附速率。在初始Pb（Ⅱ）濃度為50 mg·L-1、溶液pH為5.5、吸附劑用量為0.2 g·L-1和反應溫度為30℃的條件下，研究時間對DC和LC吸附Pb（Ⅱ）的影響及DC和LC的吸附動力學行為。

時間對DC和LC吸附Pb（Ⅱ）的影響見圖6。隨著時間的增加，DC和LC對Pb（Ⅱ）的吸附量明顯增加，表明在吸附劑表面存在大量可用的活性位點，且Pb（Ⅱ）吸附到了吸附劑的表面。從圖6可知，DC和LC對Pb（Ⅱ）的吸附在60 min可達到吸附平衡，因此選擇60 min作為DC和LC后續實驗的反應時間。

圖6 反應時間對DC和LC吸附Pb（Ⅱ）的影響及準一級動力學和準二級動力學模型擬合結果Figure 6 Effect of contact time on adsorption of Pb（Ⅱ）by DC and LC and the fitting results using pseudo-first-order and pseudo-second-order models

微生物細胞的吸附一般分為兩個階段：快速吸附階段和緩慢達到平衡的慢速吸附階段。文獻中報道的有超過25種模型嘗試定量的描述吸附過程的動力學行為，盡管各個模型都有其局限性，但是準一級動力學模型和準二級動力學模型已經被成功應用于對吸附數據的擬合[9]。準一級動力學模型是基于假設吸附速率受擴散步驟的控制，吸附速率與平衡吸附量和t時刻的吸附量的差值呈正比關系，主要用于通過邊界擴散完成的單層吸附；準二級動力學模型是假設吸附速率受化學吸附過程的控制，其涉及吸附劑與吸附質之間存在共用電子或者電子轉移，吸附過程包含了外部液膜擴散、表面吸附以及顆粒內擴散的復合吸附反應，因此準二級動力學模型能夠更全面地反映固-液之間的吸附動力學行為[28-29]。基于微生物細胞本身組成的均勻性，以及其表面存在與重金屬離子相結合的羥基、羧基和氨基等基團，這些基團能與金屬離子之間發生物理化學反應，因此準一級動力學模型和準二級動力學模型能夠對實驗結果進行擬合，從而判定其吸附動力學行為。準一級動力學模型和準二級動力學模型已經被廣泛用于描述微生物吸附過程的動力學行為，且多數實驗結果符合準二級動力學模型[18，30-31]。

為了分析DC和LC吸附Pb（Ⅱ）的吸附動力學行為，實驗結果使用準一級動力學模型（公式3）和準二級動力學模型進行擬合（公式4）[32]。

式中：qt是t（min）時間吸附劑對Pb（Ⅱ）的吸附量，mg·g-1；k1和k2分別為準一級動力學和準二級動力學模型的吸附速率常數，min-1和g·mg-1·min-1。實驗數據擬合見圖6和表1。

從表1可知，DC和LC對Pb（Ⅱ）的吸附結果表明，準一級動力學模型擬合的相關系數r2低于準二級動力學模型，因此，DC和LC對Pb（Ⅱ）的吸附更符合準二級動力學模型，說明兩種吸附劑的吸附過程主要是化學吸附過程，化學吸附是速率控制步驟。

表1 DC和LC對Pb（Ⅱ）的吸附動力學參數Table 1 Kinetic parameters for the adsorption of DC and LC for Pb（Ⅱ）

2.2.4 初始濃度的影響和吸附等溫線

吸附等溫線的實驗和之前的實驗是一個相似的過程，配制100 mL初始濃度分別為10、20、30、40、50、75、100 mg·L-1的Pb（Ⅱ）溶液，分別加入DC和LC，吸附劑濃度為0.2 g·L-1，溶液pH=5.5，在30 ℃的條件下，反應60 min，研究不同初始Pb（Ⅱ）濃度對DC和LC吸附效果的影響，實驗結果如圖7所示。在Pb（Ⅱ）濃度較低時，DC和LC對Pb（Ⅱ）的吸附量隨著初始Pb（Ⅱ）濃度的增加而明顯增加，表明初始Pb（Ⅱ）濃度在吸附過程中具有重要的作用，能夠在鉛離子之間產生驅動力，從而降低溶液中的Pb（Ⅱ）和吸附劑上吸附的Pb（Ⅱ）之間的傳質阻力，因此能夠加強Pb（Ⅱ）與吸附劑DC和LC之間的有效碰撞。當溶液中的Pb（Ⅱ）濃度超過一定值后（本實驗是50 mg·L-1），吸附量接近一個常數，這可能是因為吸附劑表面的吸附位點達到吸附飽和。

為了更充分地描述DC和LC對Pb（Ⅱ）的吸附特點，實驗結果使用Langmuir模型（公式5）和 Freun?dlich（公式6）模型進行擬合[33]。

式中：qmax是預測的吸附劑對Pb（Ⅱ）的最大吸附量，mg·g-1；KL是Langmuir常數，L·mg-1；KF是Freundlich常數；1/n是經驗參數。實驗數據擬合結果見圖7和表2。

從表2中的結果可知，Langmuir模型擬合的相關系數r2明顯大于Freundlich模型，說明DC和LC對Pb（Ⅱ）的吸附結果更符合Langmuir模型，吸附過程為單分子層吸附。Langmuir模型由預測的最大吸附量（qmax）和常數KL決定，DC和LC的qmax分別為134.92 mg·g-1和 116.18 mg·g-1，且 DC的 KL（0.887 2）明顯大于LC（0.266 9），從qmax和KL的對比可知，DC比LC具有更強的吸附Pb（Ⅱ）的能力。Freundlich模型的特征由KF和n決定，KF和n值越大說明吸附劑與金屬的親和力越強。從Freundlich模型擬合的結果可知，DC的KF和n值明顯大于LC，說明DC與Pb（Ⅱ）的結合能力高于LC，因此DC對Pb（Ⅱ）的吸附量高于LC。

2.2.5 溫度的影響和吸附熱力學計算

圖7 吸附等溫線及Langmuir和Freundlich模型擬合Figure 7 Adsorption isotherms and the fitting results by Langmuir and Freundlich models

表2 Langmuir和Freundlich模型擬合結果Table 2 Fitting results of adsorption isotherms based upon Langmuir and Freundlich models

配制100 mL初始濃度為50 mg·L-1的Pb（Ⅱ）溶液，分別加入DC和LC，吸附劑濃度為0.2 g·L-1，調節溶液pH為5.5，在溫度分別為25、30、35、40℃的條件下，反應60 min，研究溫度對DC和LC吸附效果的影響。根據DC和LC在不同溫度下對Pb（Ⅱ）吸附平衡數據，計算吸附過程中的熱力學參數如吉布斯自由能變ΔG、焓變ΔH和熵變ΔS，具體計算過程如下：

式中：N為理想氣體常數8.314 J·mol-1·K-1；T為溫度，K；Kd為在溫度T時的平衡常數。使用lnKd對1/T作圖擬合，焓變ΔH和熵變ΔS可以使用所得線性圖的斜率和截距計算。實驗結果見圖8和表3。

從表3可知，DC和LC在不同溫度下吸附Pb（Ⅱ）的ΔG均為負數，表明DC和LC吸附水溶液中Pb（Ⅱ）均是自發進行的。對于DC吸附Pb（Ⅱ），ΔG的絕對值隨著溫度增加而減小，表明吸附的自發能力越小；且ΔH為-15.26 kJ·mol-1，ΔH為負值表明DC吸附Pb（Ⅱ）是一個放熱過程，溫度升高不利于吸附過程的進行；ΔS＜0，說明DC對Pb（Ⅱ）的吸附過程為熵減的過程，吸附過程的隨機性減小。此結果與吳涓等[34]研究滅活的黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysospori?um）對鉛的吸附為自發放熱的過程一致。對于LC吸附Pb（Ⅱ），其表現出與DC相反的結果，ΔG的絕對值隨著溫度增加而增加，吸附的自發能力也就越大；ΔH＞0和ΔS＞0，表明LC吸附Pb（Ⅱ）是吸熱過程且吸附過程中固液界面的隨機性增加。

表3 DC和LC吸附Pb（Ⅱ）的熱力學參數Table 3 Thermodynamic parameters for the adsorption of Pb2+by DC and LC

2.3 吸附機理分析

2.3.1 FTIR分析

圖8 lnKd對1/T繪圖Figure 8 Plot of lnKdversus 1/T

圖9 LC和DC吸附Pb（Ⅱ）前及DC吸附Pb（Ⅱ）后的紅外光譜Figure 9 FTIR spectra of before adsorption of LC and DC for Pb（Ⅱ）and after adsorption of Pb（Ⅱ）by DC

FTIR是一種分析吸附劑表面官能團組成的有效手段。圖9展示了LC和DC吸附Pb（Ⅱ）前及DC吸附Pb（Ⅱ）后（DC-Pb）的FTIR光譜。從圖9 LC吸附Pb（Ⅱ）前的FTIR光譜可知，3467 cm-1和2923 cm-1分別為-OH/-NH2重疊峰和C-H的不對稱伸縮振動，該區域出現的峰為糖類典型的特征峰[19]；1670 cm-1由酰胺Ⅰ帶中C=O和C-N伸縮產生，1549 cm-1為酰胺Ⅱ帶中C-N伸縮及N-H彎曲振動產生，1245 cm-1屬于酰胺Ⅲ帶中C-N伸縮產生的吸收峰，以上特征峰表明克雷伯氏菌活細胞中存在蛋白質；1421 cm-1為-COOH對稱伸縮的吸收峰，1083 cm-1為糖環中乙醇的C-O伸縮[18]；721～964 cm-1為磷脂質或磷酸核糖基焦磷酸鏈中P-O-C和P-O-P伸縮振動[15]。由上述特征峰分析可知，克雷伯氏菌活細胞的主要成分為多糖、蛋白質和磷脂，含有羥基、氨基、羧基及磷酸基。對比LC和DC的FTIR光譜，可知在經過高溫滅菌后，失活的死細胞和活細胞的紅外光譜有明顯的不同。DC的-OH/-NH2重疊峰的峰位置發生變化及C-H峰強變弱；酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶的峰明顯增強；-COOH和糖環中乙醇C-O的峰強變弱且峰位置發生了偏移；721～964 cm-1吸收峰消失。上述變化表明，經過高溫處理后克雷伯氏菌細胞組成成分多糖、蛋白質及磷脂受到了影響，但是酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶明顯增強，表明暴露出了更多的氨基。DC吸附后，在574 cm-1出現一個新峰，表明Pb（Ⅱ）已成功被DC吸附。羥基、氨基和羧基的特征峰峰位置均發生了偏移或峰強減弱，說明它們均參與了DC對Pb（Ⅱ）的吸附過程，通過絡合配位、靜電作用和化學吸附反應等作用去除Pb（Ⅱ）。但是DC對Pb（Ⅱ）的吸附效果明顯提高，可能是因為更多氨基的暴露和721～964 cm-1吸收峰消失。氨基基團的增多，使DC和Pb（Ⅱ）之間的絡合配位及靜電作用增強；721～964 cm-1吸收峰消失，表明經過高溫處理后，細胞壁不再完整，因此死細胞的細胞壁的滲透性增強使重金屬能夠更容易進入細胞內部，從而提高了吸附能力。

2.3.2 XPS分析

圖10 LC、DC和DC-Pb的XPS全譜圖Figure 10 XPS spectrum of LC，DC and DC-Pb

圖11 LC、DC和DC-Pb的N1s及O1s的XPS譜圖Figure 11 XPS spectra of N1s and O1s for the LC，DC and DC-Pb

使用X射線光電子能譜技術，對比LC、DC和DC吸附Pb（Ⅱ）后的樣品（DC-Pb）之間的差異，結果見圖10和圖11。從圖10 LC、DC和DC-Pb全譜圖可知，DC在吸附Pb（Ⅱ）后，有明顯的元素Pb的峰產生，表明Pb（Ⅱ）確實吸附到了DC的表面。為了進一步分析DC和LC的不同以及DC吸附Pb（Ⅱ）起主要作用的基團，對N1s和O1s的峰進行分峰擬合，實驗結果如圖11所示。對于N1s，LC僅在399.41 eV處擬合出NH2的一個峰，而DC在400.72、400.10 eV和399.30 eV處分別擬合出NH+3、N-C=O和NH2對應的峰[35]。說明經過高溫滅菌處理后，有更多的氨基基團暴露出來，此結果與FTIR的分析結果一致。而DC在吸附Pb（Ⅱ）后，可以看出氨基基團的峰位置及峰面積比均發生了變化，N-C=O和NH2的峰面積比分別由吸附前的41.17%和38.67%降低至37.42%和33.12%，說明氨基基團參與了吸附過程。對比LC、DC和DC-Pb的O1s的分峰擬合結果可知，LC在533.16、532.51、531.62 eV和530.75 eV處分別擬合出O-P、C-O、O=CO和O=C-NH2的峰[36-37]。DC中O-P和O=C-O的峰面積比低于LC，但C-O和O=C-NH2的峰面積比增加，表明高溫處理破壞了克雷伯氏菌細胞壁的完整性，使其他基團更多的暴露出來。在DC吸附Pb（Ⅱ）后，CO、O=C-O和O=C-NH2的結合能和峰面積比均比吸附前明顯減少，表面含氧的羥基、羧基和氨基參與了反應。羥基、羧基和氨基可以通過離子交換、表面絡合和靜電吸引等作用結合重金屬離子[38]。對于含有氨基的基團，吸附后變化最為明顯，說明氨基基團在吸附過程中的貢獻最大。

3 結論

（1）克雷伯氏菌死細胞（DC）和活細胞（LC）均能夠有效去除水中的Pb（Ⅱ），在各實驗條件下，DC對Pb（Ⅱ）的吸附量明顯高于LC。

（2）SEM和比表面積分析可知，DC比LC具有更大的比表面積，是由于高溫處理破壞了細胞的完整性且增加了細胞的通透性；Zeta電位分析表明在不同pH值條件下，在等電點之后DC比LC帶有更多的負電荷，從而利于DC細胞與金屬離子之間通過靜電作用結合。

（3）利用FTIR和XPS分析表明，經過高溫處理過的DC表面暴露出更多的氨基基團，從而對Pb（Ⅱ）具有更強的結合能力；DC中吸附Pb（Ⅱ）的官能團有羥基、羧基和氨基，其中氨基起主要作用。

（4）本研究選用的克雷伯氏菌是一種具有致病性的微生物。但是從本研究的結果可知，實驗中選用的克雷伯氏菌經過高溫滅活后無毒的死細胞比活細胞對Pb（Ⅱ）具有更高的吸附能力。實驗結果一方面為克雷伯氏菌在實際生產應用中提供了理論指導，另一方面表明克雷伯氏菌經過高溫處理失去活性后為一種綠色、環保的生物吸附劑，大幅提高了其在處理含重金屬廢水的過程中的利用潛力及實際應用的意義。