西江流域地表水微生物污染定量源解析

張 楊,吳仁人,楊 戈,汪 光,王一舒,林凱榮,李開明,鐘 杰

?

西江流域地表水微生物污染定量源解析

張 楊1,2,吳仁人2,3*,楊 戈4,汪 光2,3,王一舒2,3,林凱榮1*,李開明2,3,鐘 杰5

(1.中山大學(xué)水資源與環(huán)境系,廣東 廣州 510275；2.環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所,廣東 廣州 510530；3.廣東省水與大氣污染防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510530；4.肇慶市環(huán)境保護(hù)監(jiān)測(cè)站,廣東 肇慶 526040；5.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510550)

水體微生物污染標(biāo)記物的源強(qiáng)特征是定量解析微生物污染來源的關(guān)鍵.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)分別對(duì)人源(qHS601F/qBac725R)、牛源(BacB2-590F/Bac708Rm)、豬源(Bac41F/Bac163R)及禽類(qC160F-HU/qBac265R-HU)特異性擬桿菌引物的源強(qiáng)特征進(jìn)行了探索,并進(jìn)一步對(duì)西江流域廣東段進(jìn)行微生物污染來源定量解析,結(jié)果表明:針對(duì)不同目標(biāo)宿主,不同特異性擬桿菌引物的源強(qiáng)特征為人源(qHB)>豬源(qPB)>牛源(qRB)>禽類(qCB),DNA模板濃度對(duì)引物的源強(qiáng)特征影響較小.選取的目標(biāo)研究區(qū)域水體普遍受到人、豬、牛及禽類糞便污染.干流中qHB、qCB及qPB自上游至下游緩慢升高.各支流中qHB、qCB及qPB的平均濃度較干流均上升了1個(gè)數(shù)量級(jí),qRB在不同河段變化較小.說明下游河段的生活污水、豬源及禽類糞便污染較為嚴(yán)重,牛源污染的影響較小.統(tǒng)計(jì)分析顯示在污染水平較高的各支流中,人源特異性擬桿菌引物與傳統(tǒng)指示菌具有一定的相關(guān)性(<0.05),說明生活污水是傳統(tǒng)指示菌濃度較高的主要原因,且為持續(xù)排放源.

微生物污染；源強(qiáng)；定量；西江

潛藏于畜禽糞便及生活污水中的病原微生物是威脅人類健康的主要原因之一,我國大部分地表水均已受到不同程度的病原微生物污染[1].為有效治理水體中的微生物污染,歐美等發(fā)達(dá)國家已率先開發(fā)出了人[2]、豬[3]、牛[4]、雞[5]等動(dòng)物的宿主特異性引物,成功識(shí)別了部分地區(qū)地表水或近海水域微生物污染來源[6-7].我國研究人員也相繼在部分地區(qū)篩選出適用于目標(biāo)研究區(qū)域的宿主特異性擬桿菌標(biāo)記[8-10],并對(duì)其實(shí)際應(yīng)用的有效性進(jìn)行了探索.

然而,由于特異性標(biāo)記是針對(duì)不同動(dòng)物腸道菌的特異性片段開發(fā)而來,因此,不同標(biāo)記的源強(qiáng)特征也不盡相同.例如,有研究表明當(dāng)致病菌濃度上升至對(duì)3%接觸人群帶來潛在威脅時(shí),引物HF183的檢出濃度為4200copies/100mL,而HumM2為2800copies/100mL[11].同為針對(duì)人源擬桿菌特異性片段開發(fā)出的引物,源強(qiáng)特征具有明顯差異.

目前,我國關(guān)于微生物污染源解析技術(shù)的研究尚處于起步階段,對(duì)宿主特異性標(biāo)記的源強(qiáng)特征研究較少,且與現(xiàn)行的地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB3838- 2002)相脫節(jié)[12],這對(duì)管理部門制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)帶來了困難.本研究選取了適用于珠江三角洲地區(qū)的人及常見畜禽動(dòng)物擬桿菌特異性標(biāo)記,探索其對(duì)宿主糞便的源強(qiáng)特征.同時(shí),以西江流域廣東段為目標(biāo)研究區(qū)域,定量解析了不同來源的糞源微生物在水體中的濃度水平,并探索了與傳統(tǒng)指示菌之間的相關(guān)關(guān)系, 以期為該地區(qū)地表水微生物污染的有效控制提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器: Quanti-tray 97孔定量盤(IDEXX公司),生化培養(yǎng)箱(三洋公司),冷凍離心機(jī)(Sigma公司), 核酸蛋白分析儀(DU730,BeckMan Coulter公司),紫外可見分光光度計(jì)(DR2800,HACH公司),熒光定量PCR儀(LightCycler 480Ⅱ,Roche公司),多模塊基因擴(kuò)增儀(FlexCycler2,耶拿公司).T-Green藍(lán)光切膠儀(TIANGEN公司).

主要試劑:COD低量程預(yù)制試劑(HACH公司),科立得試劑(IDEXX公司),HiPure Water DNA Kit (D3145-02,Magen公司), TIANamp Stool DNA Kit (DP328-02,TIANGEN公司),Talent qPCR PreMix (TIANGEN公司),瓊脂糖(Biowest,電泳級(jí)),Universal DNA Purification Kit(DP214-03, TIANGEN公司), TIANprep Mini Plasmid Kit(DP103-03, TIANGEN公司).

1.2 研究區(qū)域概況

圖1 西江流域采樣點(diǎn)分布示意

選取西江流域封開城上至富灣水廠段作為目標(biāo)研究區(qū)域,對(duì)其微生物污染的來源組成及污染強(qiáng)度進(jìn)行了解析.該流域封開城上至三榕峽段沿線分布著封開縣、郁南縣、德慶縣等人口密度相對(duì)較小的縣級(jí)行政區(qū)以及人口相對(duì)較密集的云浮市城區(qū). 該河段主要支流包括賀江、羅定江、南山河等.其中,賀江流經(jīng)封開縣城,由江口鎮(zhèn)左岸匯入西江.羅定江流經(jīng)羅定縣、郁南縣,在郁南縣境內(nèi)匯入西江.南山河流經(jīng)云浮市城區(qū)后匯入西江.三榕峽至富灣水廠段主要經(jīng)過肇慶市城區(qū),附近人口較為密集,且養(yǎng)殖業(yè)數(shù)量及規(guī)模均大于上游河段. 該河段存在的主要支流為新興江和北江支流.新興江主要流經(jīng)云浮市新興縣和肇慶市高要區(qū),于高要區(qū)匯入西江.北江支流為西江與北江的混流通道,附近存在較多農(nóng)田.具體采樣點(diǎn)如圖1所示.

1.3 樣品采集

糞便樣品:2017年7月~2017年9月,在珠江三角洲地區(qū)多個(gè)畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)采集豬、牛、雞的糞便樣品,在廣州市某醫(yī)院采集人糞樣品.糞便樣品共計(jì)40份,其中人10份,豬10份,牛10份,雞10份.樣品采集后置于冰盒中,6h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室放入-80℃冰箱中保存,留待后續(xù)處理.

水體樣品:根據(jù)圖1設(shè)置的采樣點(diǎn)進(jìn)行水樣采集.所有樣品采集后進(jìn)行編號(hào),并保存于冰盒中,6h內(nèi)運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行過濾,過濾后富集微生物的濾膜置于-80℃冰箱中,留待DNA提取.過濾方法見1.4.3.

1.4 分析方法

1.4.1 水體中理化指標(biāo)的測(cè)定 COD的測(cè)定采用HACH公司低量程(LR)重鉻酸鉀法預(yù)制試劑.氨氮的測(cè)定采用納氏試劑分光光度法(HJ 535-2009).總磷采用鉬酸銨分光光度法(GB 11893-1989)進(jìn)行測(cè)定.總氮的測(cè)定采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法(HJ 636—2012).

1.4.2 傳統(tǒng)指示菌的測(cè)定 傳統(tǒng)指示菌的測(cè)定采用固定酶底物法.取100mL水樣分別加入滅菌瓶中,同時(shí)加入科立得試劑進(jìn)行混勻.當(dāng)試劑在水樣中完全溶解后,轉(zhuǎn)移至97孔定量盤內(nèi),進(jìn)行封口.大腸埃希氏菌的培養(yǎng)放入(37.0±0.2)℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng),糞大腸菌群則放入(44.5±0.2)℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24h后進(jìn)行計(jì)數(shù).

1.4.3 DNA提取 糞便DNA提取:糞便樣品DNA的提取按照TIANGEN公司DP328-02試劑盒說明書進(jìn)行提取.每份糞便樣品均稱量0.2g.洗脫液TB均加入40μL.

水體DNA提取:采用0.22μm濾膜過濾100mL水樣,使菌體留在濾膜上.并按照水體DNA提取試劑盒的說明書提取留在菌體上的DNA.DNA樣品置于-20℃冰箱中保存.

1.4.4 qPCR分析 通過總細(xì)菌引物、通用擬桿菌引物、大腸埃希氏菌引物及各宿主特異性擬桿菌引物對(duì)提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,引物序列如表1所示.qPCR擴(kuò)增體系:SYBR Green Talent qPCR Premix(2×)(購自TIANGEN公司)10μL; 上、下游引物各0.8μL;DNA 模板2μL;ddH2O補(bǔ)足反應(yīng)體系至20μL.qPCR擴(kuò)增程序:①預(yù)變性,95℃,30s;②變性,95℃,5s;③退火延伸,60℃,1min.40 個(gè)循環(huán). 擴(kuò)增體系與程序參照TIANGEN公司 Talent qPCR PreMix說明書.

表1 特征生物標(biāo)記引物

1.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 以提取的各基因組DNA為模板,通過引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增.純化回收擴(kuò)增后的目標(biāo)產(chǎn)物,并與pMD 19-T Vector載體相連接,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞.通過含有抗生素氨芐的固體培養(yǎng)基挑取陽性克隆,提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序.基因序列提交至GenBank 進(jìn)行同源性比對(duì),結(jié)果顯示(未列出),人源qHB、豬源qPB、牛源qRB、雞源qCB特異性擬桿菌引物及通用擬桿菌引物qGB與通用引物互補(bǔ)的序列均為各自目標(biāo)菌株不同株系的16S rRNA 基因片段,說明所選引物有較高的特異性.總細(xì)菌引物qTB中含有梭菌屬、不動(dòng)桿菌等其他多種菌株的核酸序列.

采用超微量分光光度計(jì)測(cè)定提取的質(zhì)粒DNA濃度,并對(duì)各質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋,稀釋為10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-77個(gè)梯度.以各梯度的DNA為模板,進(jìn)行qPCR擴(kuò)增,每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù).qPCR反應(yīng)結(jié)束后,根據(jù)結(jié)果,采用SPSS 22軟件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算擴(kuò)增效率().引物標(biāo)準(zhǔn)曲線的2均大于0.99,結(jié)果可信.擴(kuò)增效率()是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率來確定的,兩者符合公式=10(-1/Slope)-1.若一個(gè)反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.32,則擴(kuò)增效率= 100%[10].一般認(rèn)為擴(kuò)增效率()在90%~110%之間是可接受的.研究中涉及的pair-t test及Pearson相關(guān)性分析也均采用SPSS 22軟件進(jìn)行.

2 結(jié)果與討論

2.1 宿主特異性擬桿菌引物的源強(qiáng)特征分析

每份糞便樣品分別稱取0.2g進(jìn)行DNA提取.提取過程中,為判斷不同宿主糞便DNA提取效果的差異,洗脫液TB均加入40μL.提取結(jié)果如表2所示.

表2 不同宿主糞便的DNA提取效果

由于糞便中不僅含有腸道微生物,還存在消化酶、未消化的食物、膽堿、多糖等多種雜質(zhì),會(huì)降解DNA并抑制PCR反應(yīng)[17].因此,保證目標(biāo)DNA的提取純度和濃度是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵.由表2可知,不同樣本提取的基因組A260/280均介于1.8~2.0之間,基因組純度較高.然而,以等量糞便和等體積洗脫液獲得的DNA濃度差異較大.其中,人糞樣本的DNA濃度均值為109.91ng/μL,顯著高于其它樣品(< 0.05).豬糞樣品中得到的DNA濃度最低(71.16ng/ μL),顯著小于同為哺乳動(dòng)物的人和牛(<0.05).不同動(dòng)物的腸道微生物多樣性及密度等因素均會(huì)影響DNA的提取濃度.已有研究表明,哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)的微生物密度遠(yuǎn)高于其他物種[18].而本研究中,由牛糞和豬糞中獲得的DNA濃度均小于雞,這與王海鷹等[8]在珠江三角洲地區(qū)篩選擬桿菌引物時(shí)獲取的DNA濃度結(jié)果較為相似,表明糞便DNA的提取濃度不僅與腸道微生物的密度與多樣性相關(guān),還受到其它多種因素干擾.例如,當(dāng)糞便脫離宿主時(shí),水分含量的不同也會(huì)對(duì)DNA提取濃度產(chǎn)生影響[19].

為排除DNA濃度對(duì)引物源強(qiáng)特征的干擾,分別將各目標(biāo)DNA稀釋至10ng/μL后進(jìn)行qPCR.同時(shí),對(duì)未作稀釋處理的DNA模板進(jìn)行同步擴(kuò)增,用于對(duì)比DNA濃度和引物源強(qiáng)特征對(duì)定量源解析的影響程度.結(jié)果如圖2所示.

由圖2(a)可以看出,當(dāng)DNA模板濃度相同時(shí),qHB的平均濃度可達(dá)9.72Log10(copy numbers)/g,檢出水平較高,說明該引物對(duì)人糞污染具有較好的靈敏性,在人源糞便污染強(qiáng)度較小或污染物被稀釋的情況下,也能檢測(cè)到相應(yīng)的特異性擬桿菌片段.其次為qPB、qRB和qCB,分別較qHB下降了0.21, 0.24,2.77Log10(copy numbers)/g,說明qCB的靈敏性顯著低于其它引物,若以qCB作為評(píng)價(jià)指標(biāo),可能會(huì)導(dǎo)致低估環(huán)境中禽類糞便的污染水平.對(duì)比未稀釋至等濃度DNA模板的擴(kuò)增結(jié)果可知(圖2b),二者檢出濃度由高至低的排序結(jié)果一致,表明不同的DNA濃度對(duì)qPCR定量結(jié)果影響較小.總體而言,擬桿菌在人、豬、牛等哺乳動(dòng)物腸道中為優(yōu)勢(shì)菌群[20].而大多數(shù)禽類腸道中的梭狀芽胞桿菌和芽孢桿菌等含量均高于擬桿菌[5].因此,哺乳動(dòng)物糞便中的擬桿菌檢出率明顯大于禽類[8].相應(yīng)地,各擬桿菌標(biāo)記物的源強(qiáng)特征也表現(xiàn)為單位質(zhì)量糞便下,哺乳動(dòng)物擬桿菌引物的檢出拷貝數(shù)普遍大于禽類擬桿菌引物.

圖2 不同動(dòng)物的特異性擬桿菌引物源強(qiáng)分析 Fig.2 Source strength analysis of specific Bacteroides primers in different animals

2.2 擬桿菌標(biāo)記物的濃度水平

圖3 西江流域各引物總體檢出水平

應(yīng)用qPCR技術(shù)對(duì)西江流域廣東段干流及附近支流展開微生物污染定量源解析.流域內(nèi)各引物總體檢出濃度情況如圖3所示.通用擬桿菌引物(qGB)在流域內(nèi)的變化范圍在6.09~10.15Log10(copy numbers)/100mL,平均值為7.7Log10(copy numbers)/ 100mL,檢出水平顯著高于特異性擬桿菌引物(<0.05),說明qGB盡管不含有特異性基因片段,不能識(shí)別微生物污染來源,但可以避免低估糞便污染水平[22].當(dāng)以特異性擬桿菌引物考察流域內(nèi)微生物污染源強(qiáng)時(shí),污染強(qiáng)度依次為qHB>qCB>qPB>qRB,人源糞便即生活污水對(duì)該流域的污染較為嚴(yán)重.

2.3 不同來源微生物污染的分布特征

目標(biāo)研究區(qū)域的干流共布設(shè)了7個(gè)采樣點(diǎn).由于G4~G7河段附近的城市化水平相比于G1~G4河段較高,因此在分析目標(biāo)流域微生物污染時(shí)以G1~G4為目標(biāo)河流的上游,G4~G7為下游.從圖4(a)可以看出,干流下游的qHB、qCB、qPB和qRB的污染水平均要高于上游,平均濃度分別增加了0.41, 0.48,0.68,0.12Log10(copy numbers/100mL).已有研究表明,地表水的微生物污染強(qiáng)度與流域的土地開發(fā)程度、利用類型等密切相關(guān)[21,23].目標(biāo)研究區(qū)域的下游段流經(jīng)肇慶市主城區(qū),城鎮(zhèn)、居民區(qū)、養(yǎng)殖場(chǎng)較上游更為密集.因此,生活污水及養(yǎng)殖廢水對(duì)下游各河段的影響較大.然而,盡管下游的污染水平有所升高,但相比于上游均未超出1個(gè)數(shù)量級(jí).這是由于西江干流的流量較大,對(duì)污染物的稀釋作用及水體自凈能力較強(qiáng),因此附近的糞便排放源未對(duì)干流的總體水質(zhì)造成影響.另一方面,擬桿菌作為腸道菌[24],脫離宿主進(jìn)入有氧環(huán)境后會(huì)快速衰減[6],而微生物污染排放源可能距離干流較遠(yuǎn),在遷移的過程中發(fā)生較為明顯的衰減,這在一定程度上也影響了擬桿菌的檢出率及檢出水平.

進(jìn)一步對(duì)各支流的微生物污染進(jìn)行分析,結(jié)果如圖4(b)所示.各支流的微生物污染也主要以人源為主,其次為禽類、豬源和牛源.與干流相比,支流中qHB、qCB及qPB的平均濃度明顯上升1個(gè)數(shù)量級(jí),qRB也高出0.5個(gè)數(shù)量級(jí),說明糞便排放源主要位于各支流附近.同時(shí),各引物在不同支流的波動(dòng)范圍較干流也更大,qHB、qCB、qPB、qRB的檢出范圍分別在6.73~9.55,6.81~8.25,3.64~7.37,3.80~ 5.56Log10(copy numbers/100mL),表明各支流的微生物污染特征差異明顯.再結(jié)合各支流采樣點(diǎn)周邊的環(huán)境特征可以看出,河流中的微生物污染源強(qiáng)與存在于周圍的潛在污染源具有較強(qiáng)關(guān)聯(lián).例如,目標(biāo)研究區(qū)域下游各支流采樣點(diǎn)附近的商業(yè)區(qū)、居民區(qū)及養(yǎng)豬場(chǎng)明顯多于上游.同時(shí),下游的潛在污染源普遍距離附近河流較近,各支流水質(zhì)受生活污水和養(yǎng)殖廢水影響較大,qHB與qPB濃度明顯上升,其中D2、E3和E5采樣點(diǎn)尤為嚴(yán)重.值得注意的是,D2、E3采樣點(diǎn)附近還存在污水處理廠.已有研究表明[25],經(jīng)污水處理廠處理后的生活污水中仍含有大量的擬桿菌標(biāo)記,尤其以人源特異性標(biāo)記為主.因此當(dāng)污水處理廠的排放量較大時(shí),也會(huì)導(dǎo)致河流中qHB的顯著升高.而E3、E5點(diǎn)處豬源糞便污染水平的急劇增加也是導(dǎo)致干流G7采樣點(diǎn)qPB明顯上升的主要原因.

圖4 西江流域干流和沿線支流特異性引物濃度

在上游河段,位于G2~G3之間的羅定江(B1)流經(jīng)羅定縣和郁南縣,在郁南縣匯入西江.B2所在南山河主要接納了云浮城區(qū)的生活污水及部分養(yǎng)殖廢水,工業(yè)污染相對(duì)較少.B3所在悅城河也流經(jīng)莫村鎮(zhèn)、永豐鎮(zhèn)等多個(gè)城鎮(zhèn),最后于悅城鎮(zhèn)匯入西江.同時(shí),B1、B2、B3采樣點(diǎn)附近存在的居民區(qū)及養(yǎng)殖場(chǎng)也較A1、A2采樣點(diǎn)更為密集.因此,B1、B2、B3受生活污水和養(yǎng)殖廢水影響也更為嚴(yán)重, qPB較A1、A2增加了1個(gè)數(shù)量級(jí),qHB與qCB也分別上升了0.11,0.28Log10(copy numbers/100mL).然而,相比于A1、A2下游的干流監(jiān)測(cè)點(diǎn)G2,位于B1、B2、B3下游的監(jiān)測(cè)點(diǎn)G3可能由于距離各支流采樣點(diǎn)距離較遠(yuǎn),其各引物濃度反而小于G2.

盡管qPCR技術(shù)可以分析水體微生物污染特征,但該方法由于缺少統(tǒng)一的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以及對(duì)引物遷移、衰減規(guī)律的充分認(rèn)識(shí),仍存在部分缺陷.例如,對(duì)流域微生物污染水平的分析結(jié)果顯示,除E3點(diǎn)外,各采樣點(diǎn)qCB濃度均高于qPB,接近于qHB.結(jié)合引物源強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,若qCB濃度較高,流域內(nèi)禽類養(yǎng)殖污染水平應(yīng)遠(yuǎn)大于其它各污染源.然而,通過實(shí)地調(diào)研發(fā)現(xiàn)目標(biāo)研究區(qū)域仍以人為活動(dòng)影響為主,且養(yǎng)豬場(chǎng)數(shù)量較多,與監(jiān)測(cè)結(jié)果具有一定差異.這可能是由不同引物之間特異性的差距導(dǎo)致.盡管引物源強(qiáng)分析結(jié)果顯示qCB的靈敏性相比于qPB較差,但已有研究報(bào)道qPB的特異性顯著大于qCB[9].因此,不排除qCB在實(shí)際應(yīng)用中出現(xiàn)假陽性結(jié)果.隨著歐美等發(fā)達(dá)國家對(duì)微生物污染源解析技術(shù)的深入研究,研究者們已發(fā)現(xiàn)部分引物在驗(yàn)證階段雖然靈敏度與特異性均符合要求(>80%),但在實(shí)際應(yīng)用中,當(dāng)樣本量逐漸增加以及不同性質(zhì)水體對(duì)引物源強(qiáng)特征的干擾,假陽性表現(xiàn)越來越頻繁,使得部分宿主特異性引物在非目標(biāo)宿主污染的水體中得到檢出[19].同時(shí),qCB也不能區(qū)分家禽及野生飛禽的污染[15],因此qCB的檢出不能完全歸于養(yǎng)殖廢水的排放.此外,不同引物在環(huán)境中的衰減速率也不盡相同,這會(huì)導(dǎo)致不能準(zhǔn)確定量分析各污染源的污染水平.例如,Skolova等[22]在研究人源和反芻動(dòng)物擬桿菌引物在水體中的衰減規(guī)律時(shí)發(fā)現(xiàn),人源擬桿菌引物BacH在第8d仍可檢出,而牛源擬桿菌引物BacR在第6d已降至檢測(cè)線以下.在本研究中,qPB的濃度顯著小于qCB.同時(shí),干流中G1~G6采樣點(diǎn)qPB的檢出濃度也均小于qRB,這可能是由于qPB衰減速率較快導(dǎo)致分析結(jié)果與流域內(nèi)養(yǎng)殖分布的實(shí)際情況存在一定差異.因此,在應(yīng)用擬桿菌特異性標(biāo)記分析水體污染特征時(shí),應(yīng)預(yù)先針對(duì)目標(biāo)研究區(qū)域及所選引物進(jìn)行引物特性驗(yàn)證,分析其在不同環(huán)境條件下的遷移、衰減規(guī)律,對(duì)不同的宿主特異性引物建立相關(guān)檢出標(biāo)準(zhǔn),以便研究者們能夠準(zhǔn)確定量分析水體中微生物污染源強(qiáng).

2.4 微生物標(biāo)記與傳統(tǒng)指示菌的相關(guān)性

由于擬桿菌標(biāo)記對(duì)水體中DO的變化較為敏感,因此FIB與擬桿菌標(biāo)記物的搭配使用是一種監(jiān)測(cè)微生物污染的有效策略[26-28],可以判斷出FIB濃度升高的主要貢獻(xiàn)源及持續(xù)污染源.例如,Shane等[29]在研究指示菌的衰減規(guī)律時(shí)指出,擬桿菌標(biāo)記物在環(huán)境中的衰減速率顯著大于FIB,對(duì)糞便污染的指示性有時(shí)間限制.因此根據(jù)標(biāo)記物與FIB的相關(guān)關(guān)系,可以判斷出水體中的持續(xù)污染源[30].對(duì)照本研究中擬桿菌引物與傳統(tǒng)指示菌的相關(guān)性分析可知,在水質(zhì)較好的干流中,微生物標(biāo)記與傳統(tǒng)指示菌不具有顯著的相關(guān)性(未列出).而在微生物污染水平較高的各支流中(表3),qHB與CEC、CFC相關(guān)性較好(<0.05),這與之前的文獻(xiàn)中指出在以人源糞便污染為主的城市地表水中,人源擬桿菌特異性引物與傳統(tǒng)指示菌具有較好的相關(guān)性報(bào)道一致[9],說明生活污水是導(dǎo)致西江流域各支流CEC、CFC濃度較高的主要原因.同時(shí),可以初步判斷生活污水為該流域的持續(xù)污染源.

表3 特異性擬桿菌引物與傳統(tǒng)指示菌的相關(guān)性分析

注:表示相關(guān)系數(shù);表示顯著性,<0.05顯著相關(guān).

3 結(jié)論

3.1 各特異性擬桿菌引物針對(duì)等濃度及非等濃度DNA模板的源強(qiáng)特征均為qHB>qPB>qRB>qCB.引物的源強(qiáng)特征受DNA濃度影響較小.

3.2 在目標(biāo)研究區(qū)域水體,干流中的qHB、qCB、qPB呈現(xiàn)出隨河流流向緩慢升高的趨勢(shì).而各支流監(jiān)測(cè)點(diǎn)中的qHB、qCB及qPB較干流均上升了1個(gè)數(shù)量級(jí),qRB上升了0.5個(gè)數(shù)量級(jí).下游各支流的qHB、qCB及qPB的平均濃度也均高于上游河段,而qRB略有下降,說明該流域下游水體受人源、豬源和禽類的污染強(qiáng)度明顯高于上游,但牛源糞便污染對(duì)水質(zhì)影響較小.

3.3 在污染水平較高的支流中,qHB與傳統(tǒng)指示菌具有一定的相關(guān)性(<0.05),表明生活污水是導(dǎo)致傳統(tǒng)指示菌濃度較高的主要原因,且對(duì)水體造成了持續(xù)污染.

[1] 魏源送,鄭嘉熹,王光宇,等.地表水微生物溯源技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用進(jìn)展 [J]. 水資源保護(hù), 2016,32(1):1-11.

[2] Gawler A H, Beecher J E, Brand?o J, et al. Validation of host-specific Bacteriodales 16S rRNA genes as markers to determine the origin of faecal pollution in Atlantic Rim countries of the European Union [J]. Water Research, 2007,41(16):3780-3784.

[3] Mieszkin S, Furet J P, Corthier G, et al. Estimation of pig fecal contamination in a river catchment by real-time PCR using two pig-specific Bacteroidales 16S rRNA genetic markers [J]. Applied & Environmental Microbiology, 2009,75(10):3045-3054.

[4] Ahmed W, Powell D, Goonetilleke A, et al. Detection and source identification of faecal pollution in non-sewered catchment by means of host-specific molecular markers [J]. Water Science & Technology A Journal of the International Association on Water Pollution Research, 2008,58(3):579-86.

[5] Lu J, Santo D J, Shanks O C. Identification of chicken-specific fecal microbial sequences using a metagenomic approach [J]. Water Research, 2007,41(16):3561-74.

[6] Harwood V J, Brownell M, Wang S, et al. Validation and field testing of library-independent microbial source tracking methods in the Gulf of Mexico [J]. Water Research, 2009,43(19):4812-4819.

[7] Oyafuso Z S, Baxter A E, Hall J E, et al. Widespread detection of human- and ruminant-origin Bacteroidales markers in subtidal waters of the Salish Sea in Washington State [J]. Journal of Water & Health, 2015,13(3):827.

[8] 王海鷹,賈樂華,吳仁人,等.特異性擬桿菌引物在珠江三角洲的適應(yīng)性研究 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2014,34(8):2118-2125.

[9] 張 楊,吳仁人,張一敏,等.珠三角河網(wǎng)地區(qū)糞便污染源解析[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2017,37(9):3446-3454.

[10] 王顯貴,郭 萍,田云龍,等.利用qPCR定量檢測(cè)水體中豬源擬桿菌特異性生物標(biāo)記的研究 [J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2013,32(11): 2302-2308.

[11] Boehm A B, Soller J A, Shanks O C. Human-Associated Fecal Quantitative Polymerase Chain Reaction Measurements and Simulated Risk of Gastrointestinal Illness in Recreational Waters Contaminated with Raw Sewage [J]. Environmental Science & Technology Letters, 2015,2(10):270-275.

[12] 陳亞楠,王亞煒,魏源送,等.不同功能地表水體中病原微生物指示物的標(biāo)準(zhǔn)比較 [J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2015,35(2):337-351.

[13] Okabe S, Okayama N, Savichtcheva O, et al. Quantification of host-specific Bacteroides–Prevotella 16S rRNA genetic markers for assessment of fecal pollution in freshwater [J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2007,74(4):890-901.

[14] S M, Jf Y, R J, et al. Phylogenetic analysis of Bacteroidales 16S rRNA gene sequences from human and animal effluents and assessment of ruminant faecal pollution by real-time PCR [J]. Journal of Applied Microbiology., 2010,108(3):974-984.

[15] Kobayashi A, Sano D, Hatori J, et al. Chicken- and duck-associated Bacteroides – Prevotella genetic markers for detecting fecal contamination in environmental water [J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2013,97(16):7427-7437.

[16] Siefring S, Varma M, Atikovic E, et al. Improved real-time PCR assays for the detection of fecal indicator bacteria in surface waters with different instrument and reagent systems [J]. Journal of Water & Health, 2008,6(2):225-237.

[17] 趙健元,李進(jìn)華.一種高效的哺乳動(dòng)物糞便DNA提取通用方法 [J]. 激光生物學(xué)報(bào), 2008,17(5):695-700.

[18] 姜海燕.腸道菌對(duì)旋毛蟲存活、繁殖及蛋白表達(dá)變化影響的研究[D]. 長春:吉林大學(xué), 2016.

[19] Harwood V J, Staley C, Badgley B D, et al. Microbial source tracking markers for detection of fecal contamination in environmental waters: relationships between pathogens and human health outcomes [J]. Fems Microbiology Reviews, 2013,38(1):1-40.

[20] 張 曦,朱昌雄,朱紅惠.利用擬桿菌分子標(biāo)記物對(duì)糞便污染溯源的研究進(jìn)展 [J]. 微生物學(xué)報(bào), 2011,51(7):863-868.

[21] 王江權(quán),康 敉,鄭 祥,等.海河流域典型河流糞源性指示微生物的污染特征及其時(shí)空分布 [J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2017,37(1):138-145.

[22] Sokolova E, str?m J, Pettersson T J R, et al. Decay of Bacteroidales Genetic Markers in Relation to Traditional Fecal Indicators for Water Quality Modeling of Drinking Water Sources [J]. Environmental Science & Technology, 2012,46(2):892-900.

[23] Gotkowska-P?achta A, Go?a? I, Korzeniewska E, et al. Evaluation of the distribution of fecal indicator bacteria in a river system depending on different types of land use in the southern watershed of the Baltic Sea [J]. Environmental Science & Pollution Research, 2016,23(5): 4073-4085.

[24] Ahmed W, Yusuf R, Hasan I, et al. Quantitative PCR assay of sewage-associated Bacteroides markers to assess sewage pollution in an urban lake in Dhaka, Bangladesh [J]. Canadian Journal of Microbiology, 2010,56(10):838.

[25] Kirs M, Caffaro-Filho R A, Wong M, et al. Evaluation of human- associated Bacteroides spp. and human polyomaviruses as microbial source tracking markers in Hawaii [J]. Applied & Environmental Microbiology, 2016,82(22):6757-6767.

[26] Bachoon D S, Markand S, Otero E, et al. Assessment of non-point sources of fecal pollution in coastal waters of Puerto Rico and Trinidad [J]. Marine Pollution Bulletin, 2010,60(7):1117-1121.

[27] Mcquaig S, Griffith J, Harwood V J. Association of fecal indicator bacteria with human viruses and microbial source tracking markers at coastal beaches impacted by nonpoint source pollution [J]. Applied & Environmental Microbiology, 2012,78(18):6423.

[28] Marti R, Mieszkin S, Solecki O, et al. Effect of oxygen and temperature on the dynamic of the dominant bacterial populations of pig manure and on the persistence of pig-associated genetic markers, assessed in river water microcosms [J]. Journal of Applied Microbiology, 2011,111(5):1159-1175.

[29] Rogers S W, Donnelly M, Peed L, et al. Decay of bacterial pathogens, fecal indicators, and real-time quantitative PCR genetic markers in manure-amended soils [J]. Applied & Environmental Microbiology, 2011,77(14):4839-4848.

[30] Jenkins M W, Tiwari S, Lorente M, et al. Identifying human and livestock sources of fecal contamination in Kenya with host-specific Bacteroidales assays [J]. Water Research, 2009,43(19):4956-4966.

Quantitative source analysis of microorganism pollution in the surface water in Xijiang River Basin.

ZHANG Yang1,2, WU Ren-ren2,3*, YANG Ge4, WANG Guang2,3, WANG Yi-shu2,3, LIN Kai-rong1*, LI Kai-ming2,3, ZHONG Jie5

(1.Department of Water Resources and Environment, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China；2.South China Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Guangzhou 510530, China；3.The key Laboratory of Water and Air Pollution Control of Guangdong Province, Guangzhou 510530, China；4.Zhaoqing environmental protection monitoring station, Zhaoqing 526040, China；5.Department of Environmental Science and Engineering, Zhongkai University of Agriculture and Technology, Guangzhou 510550, China)., 2018,38(10)：3889~3896

Understanding the characteristic of source strength of the microbial gene marker is the key for quantitative analyzing the microbial contamination from different sources. In this study, the source strength of human-(qHS601F/qBac725R), porcine-(Bac41F/Bac163R), cattle-(BacB2-590F/Bac708Rm) and poultry-specific(qC160F-HU/qBac265R-HU) bacteroides primers were explored by qPCR method, and then quantitative analysis of the source and level of microbial pollution in Xijiang river in Guangdong province. The results showed that the source strength of different specific bacteroides primers was human(qHB)>porcine(qPB)>cattle(qRB)>poultry(qCB). The concentration of DNA had little effect on source strength of each primers. The selected target area was generally contaminated by human, pig, cattle and poultry feces. The concentration of human, porcine and poultry-specific primers were increased slowly from upstream to downstream in the main stream. In the tributary, the mean concentration of human-, porcine- and poultry-specific primers were increased 1-order magnitude compared to the main stream. qRB had little change in different section of the river. This suggests that the pollution of domestic sewage, porcine source and poultry excrement in the downstream was more serious. The influence of cattle source pollution was not significant. Statistic analysis showed that human-specific premier had a significant correlation with traditional fecal indicator bacteria in the tributary which had high level of fecal pollution(FIB)(<0.05). It reflected that human source was the major reason for the high concentration of FIB, and human feces was the persistent pollution source.

microbial pollution；source strength；quantitative；Xijiang river

X522

A

1000-6923(2018)10-3889-08

張 楊(1988-),男,寧夏銀川人,中山大學(xué)與環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所聯(lián)合培養(yǎng)博士研究生,主要從事環(huán)境微生物研究.發(fā)表論文4篇.

2018-03-27

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41303054);中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)(PM-zx703-201701-044);公益性行業(yè)科研專項(xiàng)資助項(xiàng)目(201509027);廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015A030313850)

* 責(zé)任作者, 吳仁人, 副研究員 wurenren@scies.org; 林凱榮, 教授, linkr@mail.sysu.edu.cn