多核銅槲皮素配合物的制備及抗腫瘤活性測試

王繼群，張 雷，劉麗敏，張雨晴，艾莉蒳，李 婧

(黑龍江八一農墾大學 生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319)

槲皮素(quercetin，Que,5,7,3',4'-五羥基黃酮)具有廣泛的藥理活性，如降血壓、降血脂、抗炎、抗腫瘤等[1-6]。由于其溶解性差，限制了該藥品的應用。槲皮素對金屬離子具有較強的配位性，可以與多種金屬離子配位，生成配合物溶解性較好，同時表現出較強的生物活性[9-15]。因此關于槲皮素金屬配合物的研究逐漸增多，對于金屬配合物的抗腫瘤活性研究是其中的熱門課題[8-12]。

槲皮素銅配合物的研究得到密切關注[10,12]。在已報道的槲皮素銅配合物的合成中，槲皮素與金屬的配比為2∶1，即兩分子槲皮素的3-OH、4-CO與銅配位；或者配比為1∶2，即槲皮素3'-OH、4'-OH與銅配位，同時3-OH、4-CO與銅配位。

新戊酸銅由雙核銅和四個新戊酸根組成的配合物，新戊酸根具有很強的配位性能。本實驗使用新戊酸銅為原料與槲皮素反應，制備不同組成的配合物。用體外細胞實驗檢測對人肝癌細胞Hep3B的抑制活性。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器、試劑與藥品

紅外光譜使用Nicolet 380型紅外光譜儀由KBr壓片法測定。紫外光譜在thermo scientific紫外分光光度計上測定。元素分析在Vario Micro cube上測定。差熱分析在Mettler Toledo TGA/SDTA851e上測定。酶標儀使用Bio-Tek公司酶標儀。

槲皮素(上海麥克林)；DMEM高糖(美國Hyclone公司)；胎牛血清(Solarbio公司)；胰蛋白酶(Solarbio公司)；青鏈霉素(Solarbio公司)；臺盼藍(Sigma公司)；MTT(Macklin公司)；人肝癌細胞(Hep3B)取自美國模式培養物集存庫(ATCC)。

1.2 配合物的合成

1.2.1 配合物1(槲皮素:銅 = 2:1)

槲皮素(1.208 g，4 mmol)，無水乙醇(50 mL)，在100℃下攪拌直至全部溶解。隨后加入新戊酸銅(0.532 g，1 mmol)，攪拌回流1 h，抽濾后得黑色產物，產量1.083 g。元素分析：實際值C: 47.22%，H:3.67%；理論值C: 47.66%，H:3.73%。IR(KBr,cm-1)：3480～3272 b,1650 s，1599 s,1508 s,1432 w,1369 w,1321 w,1271 s,1208 w,1098 w,1016 w,824 w,625 w。

1.2.2 配合物2(槲皮素∶銅 = 1∶1)

槲皮素(0.604 g，2 mmol)，無水乙醇(50 mL)，在100℃下攪拌直至全部溶解。隨后加入新戊酸銅(0.532 g，1 mmol)，攪拌回流1 h，抽濾后得黑色產物，產量0.947 g。元素分析：實際值C: 44.39%，H: 3.88%；理論值C: 44.83%，H: 4.08%。IR(KBr,cm-1)：3510～3315 b,2967 w,1640 m,1597 s,1536 m,1484 s,1415 w,1357 m,1320 m,1268 s,1201 w,1094 w,813 w,624 w。

1.3 細胞培養

將人肝癌細胞(Hep3B)置于含有體積分數10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM高糖培養基中，在37℃、5%CO2條件下培養至第三代對數生長期。

1.4 槲皮素銅配合物的體外抗癌活性測試

1.4.1 對細胞形態的影響

取對數期Hep3B細胞接種于96孔板，每孔150 μL，細胞數約為8000個，于5%CO2，37℃培養箱中培養8 h后，細胞貼壁并恢復生長狀態。配合物1和2用DMSO溶解至200 μg/mL，取1 μL加入到細胞中，繼續培養24 h、48 h后，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態的變化。

1.4.2 MTT法檢測細胞毒性

取對數生長期Hep3B細胞接種于96孔板上，每孔液體150 μL，細胞數約為10000個，于5%CO2，37℃培養箱中培養8 h至細胞完全貼壁后加藥。用DMSO將配合物1、2、槲皮素、新戊酸銅稀釋至濃度為250.00、200.00、125.00、62.50、31.25、15.63、3.91 μg/mL，每孔滴加藥物1 μL，另設溶劑對照組(DMSO)。細胞繼續培養24 h、48 h。培養結束后每孔加10 μL濃度為5 mg/mL 的MTT，置于37℃、5%CO2條件下再繼續培養4 h。移去上清液，每孔加入DMSO(150 μL)，振蕩5 min，利用酶標儀于490 nm處測定各孔吸光度值，計算細胞存活率，繪制成細胞存活率曲線圖，用SPSS計算細胞毒性IC50值。

2 結果與討論

2.1 槲皮素銅配合物組成及結構分析

2.1.1 紅外解析

槲皮素、新戊酸銅與配合物1、2用紅外光譜表征，主要譜峰與官能團分析如表1。

表1 各化合物官能團與吸收峰對照表

配合物1、2中未見雙酚結構吸收峰，說明3'-OH、4'-OH參與配位。在624 cm-1或625 cm-1處都含有配位水分子振動峰。配合物2中有新戊酸根C-H振動峰。配合物1、2中，槲皮素C=O振動位移變換較小，表明未參與配位。

2.1.2 紫外光譜解析

槲皮素、配合物1和2用紫外光譜進行表征。待測樣品用甲醇溶解，在200～600 nm范圍檢測紫外吸收。槲皮素在甲醇中的紫外吸收光譜中有兩個吸收帶，帶I由B環電子π-π*躍遷吸收引起的，在375 nm處；帶II由A環π-π*躍遷吸收引起的，在260 nm處。在金屬配合物1和2中，帶I紅移，在440 nm處，說明B環3'-OH和4'-OH參與配位。帶II幾乎未變，說明A環未參與配位。

2.1.3 元素分析與熱重分析

元素分析配合物1實際值C: 47.22%，H: 3.67%；配合物2實際值C: 44.39%，H: 3.88%；差熱熱重實驗顯示，配合物在200℃以下均有質量減少，說明分子內含有結晶水或配位水。

綜合多項實驗結果得出配合物結構如圖1所示。配合物1的結構式與文獻報道[13-15]相同。配合物2的結構推測為2分子槲皮素與2分子Cu配位，1分子新戊酸根和兩分子水參與配位。在此種結構組成中，配合物1和2的元素分析的實際值與理論值較為一致。

圖1 配合物分子結構

2.2 配合物1、2對Hep3B細胞形態的影響

A：配合物1(200.00 μg/mL)；B：配合物2(200.00 μg/mL)；C：空白對照。圖2 槲皮素銅配合物作用24 h、48 h后，倒置顯微鏡下 Hep3B的細胞形態

實驗采用倒置顯微鏡觀察細胞形態。圖2為配合物1和2在藥物濃度為200.00 μg/mL時，作用24 h、48 h后，肝癌細胞Hep3B的細胞形態。空白對照組細胞大小均一，胞質顏色透明。藥物處置細胞輪廓增強，細胞變圓浮起反差增大，細胞間接觸變松，胞質中顆粒增多。死細胞的數量增多，細胞完整性受到破壞，形成大量細胞碎片。

2.3 配合物1、2對Hep3B的細胞毒性

槲皮素金屬配合物通常具有較槲皮素強的抗腫瘤活性，對多種腫瘤細胞有抑制作用。實驗采用MTT法檢測槲皮素銅配合物1、2、槲皮素、新戊酸銅對Hep3B的細胞毒性。在加藥24 h、48 h后，不同藥物對肝癌細胞Hep3B造成了不同程度的抑制作用，如圖3所示。槲皮素的溶解度較差，在研究對細胞的抑制作用時只能檢測到62.50 μg/mL，在此濃度下，細胞抑制率達到45.78%。新戊酸銅表現出較強的細胞抑制作用，IC50值為60.50 μg/mL。配合物1在作用24 h后表現的抑制作用有限，在濃度為200.00 μg/mL時，最大抑制率達到38%，濃度升高，抑制率沒有增長。在作用48 h后表現出較強的抑制效果，IC50值為90.39 μg/mL。配合物2具有較強的抑制效果，在作用24 h和48 h的IC50值分別為125.96 μg/mL和78.08 μg/mL。配合物對肝癌細胞的抑制均呈劑量依賴，即隨藥物濃度的增加細胞的抑制效果增強。在給藥時間為24～48 h時，抑制率隨著作用時間的增強而增強，呈正相關。

A：24 h，B：48 h圖3 配合物及對照藥品對Hep3B的抑制率曲線

3 結論

本文采用摩爾配比法合成槲皮素與銅的配合物。實驗以新戊酸銅為原料利用新戊酸根的強配位性，獲得新型多核配合物。配合物2中新戊酸根橋連兩個銅原子形成雙核槲皮素銅配合物，其特殊結構使配合物2表現出較強的細胞抑制作用，在48 h時IC50值為78.08 μg/mL。