藥桑葉中活性物質的提取及對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

郝蒙蒙，崔漢釗，韓愛芝，楊 玲*

（塔里木大學生命科學學院，塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

藥桑在植物分類學上屬桑科、桑屬、黑桑種（Morus nigra L.）[1]，由于新疆南部生態環境獨特，日照時間長、晝夜溫差大、干旱[2]，使藥桑成為具有體細胞染色體倍性為自然22倍體（2n＝22x＝308）的稀貴桑樹資源[3]，目前主要分布于新疆阿克蘇、和田和喀什等地區，是新疆地區在全國獨一無二的桑種質資源[4]。現代藥理學及化學成分研究表明桑葉具有降血糖、抗氧化、抗病毒等多種藥理活性，其中生物堿以及黃酮類物質是桑葉中主要的降血糖活性成分[5]。俞靈鶯等報道給糖尿病大鼠灌胃桑葉總黃酮后，大鼠血糖濃度由18.4 mmol/L降至10.2 mmol/L（P＜0.001），降糖作用顯著[6]。陳建國等指出：桑葉多糖具有調節糖代謝、降低血糖、改善糖尿病癥狀的作用[7]。1976年Yagi等初次從桑樹中分離得到生物堿成分[8]。買買提依明等曾對藥桑葉片中的生物堿成分進行檢測，發現其主要成分為1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ），含量為1.893 3 mg/g[9]。此外，有研究表明，桑葉總黃酮也能夠抑制雙糖酶活性，從而具有顯著的降血糖作用[10]。而且將類黃酮與DNJ結合能更有效地抑制血糖上升，表明類黃酮與桑葉DNJ有一定的協同作用[11]。而中南大學湘雅醫學院生理學系對一種以桑葉為主要原料的降血糖保健品進行研究，也發現桑葉多糖、生物堿及產品中其他成分有一定的協同配伍作用[12]，以上研究均是采用的隨機濃度組合方法來研究不同物質之間的協同作用，但如何定量分析各成分之間的協同、相加或拮抗作用并未采用統計學方法。目前普遍用Chou-Talalay（又稱中位藥效法）數學模型來評價藥物協同作用效果[13]，目前針對Chou-Talalay的數學模型開發出的第3代藥物聯合作用劑量-效應分析軟件“CompuSyn”是被廣泛認可的藥物協同作用定量分析方法[14]，該公式主要用聯合指數（combination index，CI）來定量描述藥物之間的相互關系[15]。

本研究以新疆特色藥桑桑葉為材料，在本實驗室已建立的集成提取工藝基礎上，通過適當優化，獲得化學成分和含量基本穩定、具有降血糖活性的生物堿、黃酮和多糖的粗提物[16]；并以此為實驗藥物來研究其抑制α-葡萄糖苷酶的抑制作用，進一步采用CompuSyn軟件對具有活性的穩定粗提物做統計學分析，來判斷桑葉中多糖、黃酮、生物堿是否具有協同作用，旨在為更深入研究和開發新疆藥桑桑葉的藥用和經濟價值提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藥桑葉2016年7月采集于新疆庫車地區，經塔里木大學邱愛軍副教授鑒定為藥桑（Morus nigra L.）葉，藥桑葉粉碎后避光置于干燥處保存。

蘆丁 美國Merck公司；葡萄糖 上海山浦化工有限公司；4-羥基哌啶 西格瑪奧德里奇上海貿易有限公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，PNPG） 上海如吉生物科技發展有限公司；阿卡波糖片 德國拜耳醫藥有限公司；α-葡萄糖苷酶 江蘇瑞陽生物科技有限公司；所有分離純化用有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

RE-5205旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；CP224C電子天平 美國奧豪斯儀器有限公司；HH-2恒溫水浴鍋 上海愛朗儀器有限公司；恒溫干燥箱 上海嘉穎科技有限公司；Infinite M200 Pro多功能酶標儀瑞士Tecan公司；S54紫外分光光度計 上海棱光技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葉中主要活性物質的提取及純化

準確稱取干燥藥桑葉粉末300.0 g，按料液比1∶20加入6.0 L石油醚，70 ℃回流4 h，過濾，濾渣按料液比1∶20加入6.0 L體積分數65%乙醇溶液，浸泡24 h，過濾，濾液減壓濃縮得桑葉浸膏；桑葉浸膏經過樹脂分離純化，分別得到生物堿、黃酮和多糖的3 種粗提物，集成提取工藝流程如圖1所示。本實驗重復3 次，分別測定粗提物中主要成分的含量。黃酮含量測定采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法[17]，以蘆丁為標準品，制作標準曲線Y＝11.64X-0.001 2，R2＝0.999 7；生物堿含量測定采用雷氏鹽比色法[18]，以4-羥基哌啶為標準品，制作標準曲線Y＝0.169 5X+0.090 7，R2＝0.990 3；多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[19]，葡萄糖作標準品，制作標準曲線Y＝7.170 6X-0.005 2，R2＝0.991 7；分別以以上3 種方法測定桑葉浸膏、粗生物堿、粗黃酮、粗多糖中黃酮、多糖、生物堿的含量，實驗重復3 次，確定工藝穩定性。

圖 1 集成提取工藝流程圖Fig. 1 Flow chart for the synchronous extraction of active substances from mulberry leaves

1.3.2 α-葡萄糖苷酶降血糖活性測定

α-葡萄糖苷酶與其底物PNPG發生反應，生成對硝基苯（p-nitrophenyl，PNP），PNP在堿性環境下顯黃色，在400 nm左右波長處有最大吸收，在一定的質量濃度（0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL）范圍內，PNP的吸光度與α-葡萄糖苷酶活力成正比[20]。

本實驗在96微孔板中測定完成[21]，實驗共設置3組，每組3 個重復，依次為：空白組（酶液+底物）、樣品組（樣品+酶液+底物）、背景組（樣品+底物），實驗以阿卡波糖作陽性對照[22]，具體反應體系為：磷酸鹽緩沖液：空白組96 μL、實驗組80 μL、背景組96 μL；樣品：空白組0 μL、實驗組16 μL、背景組16 μL；α-葡萄糖苷酶：空白組16 μL、實驗組16 μL、背景組0 μL；PNPG：空白組16 μL、實驗組16 μL、背景組16 μL；Na2CO3：空白組100 μL、實驗組100 μL、背景組100 μL。

抑制劑對α-葡萄糖苷酶的抑制率按式（1）計算。

式中：A0為空白組吸光度；A1為樣品背景組吸光度；A2為樣品組吸光度。

1.4 數據處理

根據CompuSyn軟件需求，以半數有效劑量Dm為中心設計5 個質量濃度梯度（表1），并測定不同質量濃度下相應抑制率fa[23]，采用CompuSyn統計軟件，根據中效方程式（式（2））、CI一般式（式（3））、兩個藥物CI（式（4）），用設計的質量濃度和測得的相對應質量濃度下的抑制率繪制劑量-效應曲線（C-fa）及不同效應下的CI曲線（fa-CI）[24]，從兩供試樣品聯合的效應與CI的關系圖定量評價供試樣品間的相互作用的強度以及性質[25]，CI＝1，為相加效應；CI＞1，為拮抗效應；CI＜1，為協同效應[26]。

式中：fa為抑制率；fu為存活率，fu＝1-fa；D為單用劑量/（mg/mL）；Dm為半數有效劑量/（mg/mL）[27]；m為中效曲線的斜率；Dx為聯用劑量/（mg/mL）[28]；CI為聯合指數。

表 1 藥物質量濃度Table 1 Drug concentration

2 結果與分析

2.1 3 種粗提物中活性成分含量分析

表 2 各項粗提物中活性成分含量重現性實驗結果Table 2 Reproducibility of bioactive ingredients in crude extracts

由表2可知，各項中黃酮、生物堿、多糖含量相對偏差均滿足要求，說明各項中主要活性成分含量穩定，具有重現性，粗生物堿中黃酮含量及粗多糖中生物堿含量甚微，無法測出；且經過純化，粗黃酮中黃酮含量最高，粗多糖中多糖含量最高，粗生物堿中生物堿含量最高，相比桑葉浸膏相含量明顯增加，在其他相中明顯降低，說明純化效果明顯。

以上重復性實驗結果表明：桑葉粗黃酮、粗多糖、粗生物堿中3 種主要成分黃酮、生物堿、多糖含量均是穩定的，且具有重復性，說明該提取純化工藝穩定，得到的提取物中主要成分含量穩定。3 種提取物能夠作為降血糖活性實驗的藥物原料。

2.2 3 種提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

2.2.1 單一活性物質對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

實驗以阿卡波糖作陽性對照，在0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL 5 個質量濃度下，分別測定了生物堿相和黃酮相對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，以活性物質質量濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制抑制率曲線，如圖2所示。

圖 2 單一活性物質對α-葡萄糖苷酶的抑制Fig. 2 Inhibitory effect of single bioactive substances on α-glycosidase

由圖2可知，在0.4～1.2 mg/mL的質量濃度范圍內阿卡波糖、黃酮及生物堿都與α-葡萄糖苷酶抑制作用呈良好的線性關系，隨著質量濃度的增加，其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用也逐漸增強，且在同等質量濃度作用下，對α-葡萄糖苷酶的抑制作用：生物堿＞阿卡波糖＞黃酮。在質量濃度為1.2 mg/mL時，生物堿對α-葡萄糖苷酶的抑制率達到73.87%，表明桑葉中生物堿具有更好的降血糖活性；多糖在高質量濃度作用下具有一定的降血糖活性，其半數有效劑量約為生物堿半數有效劑量的15 倍，差異太大，因此在圖中未給出。

2.2.2 3 種主要活性物質及其相互組合物的軟件分析結果

表 3 不同單藥及合用時半數有效劑量、斜率和相關系數值Table 3 Values of Dm, m and r for bioactive substances alone and in combination

由表3可知，3 種單藥及不同藥物相互組合時r均大于0.95，表明活性物質的劑量與效應之間擁有良好的線性關系；Dm表示各活性物質的半數有效劑量，在本實驗中即各物質的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）；Dm、m由CompuSyn軟件根據中效方程（式（2））自動模擬計算。

2.2.3 不同活性物質之間相互組合對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

分別測定單藥在5 個不同質量濃度下單用或與其他單藥平行聯合作用下的抑制效應，結果如圖3所示。

圖 3 藥物單用及合用劑量-效應圖及聯合作用指數曲線圖（fa-CI）Fig. 3 Dose-effect and fa-CI curves of bioactive substances individually and in combination

由圖3可知，不同質量濃度單藥及平行質量濃度下兩兩聯合的抑制效應均呈現劑量依賴關系；根據Chou-Talalay CI法可分別得到不同組合物之間聯用的CI曲線。由圖3可知，多糖+生物堿的組合與黃酮+生物堿的組合，在0＜fa＜1時，CI均大于1，表明兩者之間相互拮抗；多糖+黃酮的組合在fa不小于0.90時，CI＜1，兩者之間具有協同作用；生物堿+多糖+黃酮三者之間相互作用在fa不小于0.95時，CI＜1，三者之間具有協同作用，綜上所述，生物堿+黃酮及生物堿+多糖兩個組合對α-葡萄糖苷酶的抑制具有拮抗作用，多糖+黃酮及黃酮+生物堿+多糖三者組合這兩組組合在高的質量濃度作用下對α-葡萄糖苷酶的抑制具有一定的協同作用。

3 討 論

獲得穩定的提取物是本實驗的關鍵，在本實驗室已建立的集成提取工藝基礎上，對提取流程進行了改進，先采用石油醚進行脫色脫脂，再用乙醇提取，用此流程提取的活性物質的化學成分和含量穩定，具有重復性，保證了α-葡萄糖降血糖活性實驗中藥物原料的可靠性。

目前主要的α-葡萄糖苷酶抑制劑包括阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等，這些藥物都存在胃腸不適等副作用。而桑葉作為降血糖的常用中藥之一，是潛在的安全有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑[30]。

本實驗以α-葡萄糖苷酶為研究對象，作用于反應底物4-硝基酚-α-葡萄糖苷，釋放出一定量的葡萄糖；當有α-葡萄糖苷酶抑制劑存在，可以抑制這一反應，使最大吸收峰值下降，其下降程度與抑制劑活性呈正比。基于此作用原理和作用特點，評價桑葉中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的多組分相互作用并探討其劑量-效應關系。

CompuSyn軟件作為分析藥物相互作用的方法，是評價劑量-效應變化的有力工具。本實驗采用3 種藥物相互作用的評價方法探討桑葉不同組分配伍組合對α-葡萄糖苷酶抑制活性的劑量-效應變化與效應關系，研究表明，桑葉中降低血糖的主要有效成分包括黃酮類、生物堿類、多糖類3 類功效成分，在本實驗室所用的質量濃度范圍和劑量配比內，其中粗生物堿的降血糖作用優于粗黃酮，粗黃酮的降血糖作用優于粗多糖，且生物堿對α-葡萄糖苷酶的抑制作用比陽性對照（阿卡波糖）更好，在本實驗室所用的質量濃度范圍和劑量配比內，黃酮+生物堿組合、多糖+生物堿組合作用時，CI＞1表現為拮抗作用，黃酮+多糖在0＜fa≤0.9時，CI＞1表現為拮抗作用，在0.90＜fa≤1時，CI＜1表現為協同作用；黃酮+多糖+生物堿三者相互作用時，在0＜fa≤0.95時CI＞1，表現為拮抗作用，在0.95＜fa≤1時，CI＜1，兩者之間表現為協同作用。上述結果顯示桑葉的活性物質之間，在高質量濃度作用下，表現為較好的協同作用，為揭示桑葉整體調節血糖作用提供了科學依據。

藥桑由于其產地獨特的地理位置，在生物活性及藥理作用方面有著獨特的特性，因此對藥桑降血糖作用的研究應做更深的分析，不能僅僅做抑制α-葡萄糖苷酶的協同或拮抗作用，需要更多的實驗數據來支持桑葉的降血糖作用，本實驗的下一步將進行體內降血糖活性實驗，來進一步探討藥桑的降血糖活性。