超聲預處理對大豆蛋白酶解物結構及抗氧化活性的影響

許 晶，韓 東，王昱婷，趙青山，張曉松，金 花*

（東北農業大學理學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆常被人們稱為“綠色牛乳”，這是因為大豆中含有豐富的蛋白質和油脂。大豆蛋白因其提取成本低、含量高、營養效價好，并且含有多種人體必需氨基酸，已成為人們所青睞的優質植物蛋白，被廣泛應用于食品工業中[1]。同時，大豆蛋白經酶水解后的產物——大豆肽具有較強的還原能力、清除自由基能力、金屬離子螯合能力和抗脂質過氧化作用，能在一定程度上清除機體內產生的多余自由基，延緩機體的衰老，降低各種老年性疾病發生的概率[2]。

蛋白質水解改性常用的方法包括酸水解法、堿水解法和酶水解法。其中蛋白質酶解改性法反應條件溫和、專一性強、安全無毒，且不影響蛋白營養價值，被認為是蛋白質改性的最佳方法[3-8]。而且研究表明經適度酶解改性后，大豆蛋白的生物活性會較原始蛋白明顯增強[9]。因此，如何調控酶解條件，實現適宜水解，進而獲得最佳生物活性的大豆蛋白水解產物成為近些年人們研究的熱點。Lamsal等[10]發現大豆蛋白酶解物的生物活性主要受其水解度、蛋白酶酶切位點和底物蛋白特性的影響。張宇昊等[11]則利用堿性蛋白酶水解花生蛋白，對酶解溫度、時間、pH值和底物濃度等酶解條件進行調控，制備出理想水解度的蛋白酶解物。然而大豆蛋白的三級和四級結構緊密，這使得大豆蛋白酶解效率降低，酶解物水解度不高。所以，科學家們采用了多種預處理手段以提高大豆蛋白酶解效率[12-14]。超聲預處理法是利用高頻聲波的剪切力和機械能所產生的空穴作用，對球狀蛋白的結構和性質進行修飾，進而提高球狀蛋白的酶解效率[15]。據報道，高強度超聲預處理會提高大豆分離蛋白的乳化性[16]。Wu Jinju等[17]還發現經超聲預處理后，大豆分離蛋白酶解物的抗氧化活性較未處理樣品有所增強。

大豆蛋白按生理功能的差別分為貯藏蛋白（約占90%）和生物活性蛋白，其中兩種主要的貯藏蛋白分別為大豆球蛋白（11S）和β-伴大豆球蛋白（7S），約占大豆蛋白總貯藏蛋白的70%。本課題組前期已經探索完善了大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的超聲預處理及酶解工藝，確定了制備高抗氧化活性大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的最佳超聲酶解工藝條件[18]。本研究則以大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白為原料蛋白，采用超聲預處理和酶解改性相結合的方法，以最佳工藝條件制備大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物，并對其結構進行初步分析和表征，探討超聲預處理對蛋白酶解物結構的影響，初步分析超聲預處理提高大豆蛋白酶解物抗氧化活性的原因，以期為大豆蛋白的有效利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂豆粕 黑龍江省哈高科大豆食品有限責任公司。

堿性蛋白酶（酶活力為2.0×105U/g） 北京奧博星生物技術有限責任公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；EL20實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；RLPHR 1-4 LSC小型冷凍干燥機 北京博勱行儀器有限公司；SC-3610型低速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；JY92-2D超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；ALPHA-T傅里葉變換紅外光譜儀 美國Bruker公司；LS55熒光分光光度計 英國PerkinElmer公司；S-3400掃描電子顯微鏡 日本日立高新技術公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白超聲預處理工藝

參考本課題組前期研究方法[18-19]，從低溫脫脂豆粕中提取的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白，并分別以大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的最佳超聲工藝進行預處理。將大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白分別與蒸餾水以3∶100（m/V）的比例混合，置于錐形瓶中，室溫（25 ℃）持續攪拌1 h。然后放入超聲波處理器探頭（φ＝0.636 cm），以20 kHz分別對大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白進行超聲預處理，具體超聲條件如下：大豆球蛋白超聲功率200 W、超聲時間30 min、超聲溫度45 ℃；β-伴大豆球蛋白超聲功率100 W、超聲時間30 min、超聲溫度50 ℃。超聲時間2 s，間隔時間2 s，將超聲預處理后的樣品冷凍干燥，存儲于密閉容器中備用。

1.3.2 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解工藝

分別準確稱取一定量經超聲預處理和未經超聲預處理的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白于圓底燒瓶中，加水配制成質量分數2%的底物溶液。將底物溶液置于水浴鍋中，調節溶液至堿性蛋白酶最適酶解pH值（pH 9.0），并調節水浴鍋至最適酶解溫度45 ℃。持續磁力攪拌的情況下，加入堿性蛋白酶開始酶解，加酶量為24 000 U/g底物。酶解進行過程中，不斷滴加0.50 mol/L的NaOH溶液，從而維持酶解樣品pH 9.0。酶解4 h后，酶解液于沸水浴中滅酶活性10 min，然后將其冷卻至室溫，再向酶解液中加入1.0 mol/L HCl溶液，調pH值為4.3。之后，將酶解液4 000 r/min離心15 min，取上清液冷凍干燥，得產物粉末，粉末于4 ℃下密封保存備用。水解度的測定采用pH-stat法[20]。

1.3.3 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的熒光光譜測定

參考Bonomi[21]和Zhang Qiuting[22]等的測定方法，并稍加修改，以蛋白質中內源性熒光基團（色氨酸基團）為探針，測定大豆蛋白酶解物熒光光譜。將超聲預處理、未處理的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）配制成質量濃度為0.02 mg/mL的溶液。以λex＝290 nm為激發波長，在300～460 nm范圍內進行掃描，選擇5 nm為激發狹縫和發射狹縫，進行熒光光譜測定。

1.3.4 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的傅里葉變換紅外光譜測定

采用KBr壓片法，準確稱取超聲預處理和未處理的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物2 mg，加入0.2 g左右的KBr，充分研磨混勻、壓片，在4 000～400 cm-1范圍內測定傅里葉變換紅外光譜[23-25]。

1.3.5 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的紫外光譜測定

將超聲預處理、未處理的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）配制成質量濃度為0.2 mg/mL的溶液。在240～360 nm范圍內進行紫外光譜掃描，測定分辨率為0.1 nm[26]。

1.3.6 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的掃描電子顯微鏡觀察

參照文獻[27]方法，在5 kV加速電壓下進行大豆蛋白酶解物微觀形貌表征。測定前，用離子噴射器對超聲預處理、未處理的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物干燥粉末表面鍍一層15 nm左右的金箔。

1.3.7 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物游離巰基含量測定

參考Shimada[28]和Ellman[29]等的測定方法，并略加改動。準確稱取5,5’-二硫雙-2-硝基苯甲酸400 mg，加Tris-甘氨酸緩沖液（0.086 mol/L Tris-0.09 mol/L甘氨酸-4 mmol/L Na2EDTA，pH 8.0）稀釋定容至100.0 mL，配制成濃度為0.01 mol/L的Ellman試劑。準確移取2.00 mL大豆蛋白酶解液與5 mL Tris-甘氨酸緩沖液均勻混合，再加入0.100 mL配制好的Ellman試劑，快速充分混勻溶液。室溫（25 ℃）靜置15 min，然后測定樣品412 nm波長處吸光度A412nm。設定不加Ellman試劑的混合溶液為空白參比，測定空白組吸光度。游離巰基含量的計算如式（1）所示。

式中：D為稀釋系數；ρ為蛋白質量濃度/（mg/mL）。

1.3.8 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的抗氧化活性測定

1.3.8.1 還原能力

參照You Lijun等[30]的測定方法，取1 mL酶解液與2.50 mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和2.50 mL 10 mg/mL的K3(Fe(CN)6)溶液混合搖勻。將混合溶液50 ℃水浴20 min。然后，向溶液中加入2.5 mL體積分數10%的三氯乙酸溶液，3 500 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，與2.5 mL超純水和0.5 mL體積分數0.1%的三氯化鐵溶液混和均勻，室溫靜置10 min。以超純水為空白，測定700 nm波長處吸光度，吸光度與樣品還原能力呈正相關，以吸光度表征還原能力。

1.3.8.2 羥自由基清除能力

參照Amarowicz等[31]的測定方法，以Fenton反應測定大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物羥自由基清除率。取1.00 mL酶解液和1.00 mL FeSO4溶液（3 mmol/L），與1.00 mL H2O2溶液（3 mmol/L）均勻混合，避光靜置10 min，然后向混合液中加入1.00 mL水楊酸乙醇溶液（3 mmol/L），繼續避光靜置30 min，測定混合樣液510 nm波長處吸光度Ai。本實驗以超純水為空白組，超純水替換水楊酸乙醇為對照組，分別測定空白組吸光度A0和對照組吸光度Aj，計算大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物羥自由基清除率（式（2））。

1.3.8.3 Fe2+螯合能力

參照Wang Xiansheng等[32]的測定方法。取1 mL酶解液與3.7 mL超純水和0.1 mL FeCl2溶液（20 mmol/L）混合均勻，室溫靜置3 min。然后向混合液中加入0.2 mL菲洛嗪（5 mmol/L），攪拌10 min，測定562 nm波長處吸光度Ai。同時，以超純水為空白，測定空白組吸光度A0，計算大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物Fe2+螯合能力（式（3））。

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 超聲預處理對大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物結構的影響

2.1.1 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的熒光光譜分析

如圖1所示，圖中λ＝360 nm的特征峰為色氨酸殘基特征峰，熒光光譜峰位、峰強的改變都反映了色氨酸所處環境的變化[33-34]。本實驗中，超聲預處理后大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的熒光光譜峰位無明顯改變，但熒光強度均有所增加，這表明超聲預處理后兩種蛋白酶解物中的色氨酸所處的微環境極性增加，即內部色氨酸更多地暴露出來，說明蛋白質三級結構有所展開[35]。并且，蛋白質活性基團的暴露會有效增強其抗氧化活性[36]，這對大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的應用有積極作用。

圖 1 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的熒光光譜Fig. 1 Fluorescence spectra of glycinin and β-conglycinin hydrolysates

2.1.2 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的傅里葉變換紅外光譜分析

圖 2 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的傅里葉變換紅外光譜分析Fig. 2 Fourier transform infrared spectra of glycinin and β-conglycinin hydrolysates

圖2為超聲預處理前后大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的傅里葉變換紅外光譜圖，其中波數1 600～1 700 cm-1的酰胺Ⅰ帶頻率與C＝O鍵伸縮振動及肽鍵的C—N伸縮振動有關，可反映蛋白質的二級結構。校正傅里葉變換紅外光譜基線、去卷積，對蛋白酶解物的酰胺Ⅰ帶圖譜作二階導數擬合、Gauss峰形擬合，完全分辨重疊在一起的不同譜帶（圖3）。各子峰與蛋白質二級結構歸屬關系為：α-螺旋結構1 650～1 660 cm-1；β-轉角結構1 660～1 680 cm-1和1 690～1 700 cm-1；β-折疊結構1 610～1 638 cm-1和1 680～1 690 cm-1；無規卷曲結構1 640～1 648 cm-1。

圖 3 超聲預處理前后大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物傅里葉變換紅外光譜的酰胺Ⅰ帶擬合圖譜Fig. 3 Second-derivative Fourier transform infrared spectra in the amide I region and Gaussian curve fitting of glycinin and β-conglycinin hydrolysates

表 1 超聲預處理前后大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的二級結構含量Table 1 Contents of secondary structures of glycinin and β-conglycinin hydrolysates%

計算各子峰和總峰峰面積，求得各二級結構的含量（表1）。對比各二級結構含量發現大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物中β-轉角、β-折疊結構含量最高，與已有報道一致[37-38]。超聲預處理后，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物中α-螺旋和β-轉角結構含量顯著升高，而無規卷曲和β-折疊結構含量顯著降低。其中大豆球蛋白酶解物β-折疊結構含量降低1.66%，β-轉角結構含量升高1.89%；β-伴大豆球蛋白酶解物β-折疊結構含量降低1.83%，β-轉角結構含量升高1.93%，說明超聲預處理能夠使得蛋白質有序結構向無序結構轉變。這是因為蛋白質的二級結構受局部氨基酸排列順序以及蛋白質分子與其他分子交互作用的影響，在超聲波空穴效應作用下，蛋白分子與其他分子的交互作用遭到破壞，從而發生解聚和重排，造成大豆蛋白二級結構含量發生變化。因此，超聲預處理的大豆蛋白酶解后，其酶解物的二級結構含量也發生相應改變。超聲預處理后酶解物β-折疊結構含量降低導致蛋白質疏水相關位點暴露，暴露的疏水性氨基酸能促進抗氧化肽與疏水性多不飽和脂肪酸相互作用，抑制脂質過氧化，進而提高蛋白質酶解物的抗氧化活性[39]。

2.1.3 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的紫外光譜分析

圖 4 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的紫外光譜Fig. 4 Ultraviolet spectra of glycinin and β-conglycinin hydrolysates

由于蛋白質中的色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、組氨酸和苯丙氨酸殘基側鏈基團對紫外光有吸收作用，不同的氨基酸有不同的生色基團。其中，色氨酸和酪氨酸的紫外吸收峰在280 nm波長附近，苯丙氨酸的紫外吸收峰在257 nm波長附近[40]。所以，采用紫外光譜來研究蛋白側鏈的變化（如酪氨酸殘基的裸露程度），以探討超聲對大豆蛋白三級結構的影響。由圖4可知，經超聲預處理后，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的紫外吸收峰的峰型、峰位雖然沒發生太大變化，但是相應吸收峰的強度明顯增大。這可能是因為超聲預處理的剪切力和空穴效應會破壞蛋白質的緊密結構，增加水解度，具有紫外吸收的芳香族氨基酸殘基，如酪氨酸殘基等暴露至蛋白質分子的表面，發色基團所處的環境由非極性向極性變化，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的三級結構部分展開[41]。

2.2 超聲預處理對大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物微觀形態的影響

圖 5 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的顯微結構Fig. 5 Microstructure of glycinin and β-conglycinin hydrolysates

如圖5所示，未經超聲預處理酶解物具有疏松結構，尺寸較大。而經超聲預處理后酶解產物尺寸明顯減小，樣品質地更加疏松，緊密性有效降低。結果表明超聲預處理能夠有效破壞蛋白質緊密結構，獲得結構疏松的處理產物，利于酶解反應進行，提高蛋白質水解度。

2.3 超聲預處理對大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解特性影響

表 2 超聲預處理大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的水解度、游離巰基含量和抗氧化活性Table 2 Degree of hydrolysis, free free sulfhydryl group contents and antioxidant activity of glycinin and β-conglycinin hydrolysates

如表2所示，與未超聲預處理的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物相比，超聲預處理后蛋白酶解物水解度顯著升高（P＜0.05），說明超聲預處理能夠有效提高酶解效率。本課題組前期研究結果表明過長的超聲時間（30 min）、過高的超聲溫度（45 ℃）和超聲功率（200 W）反而對提高水解度不利[18]。這是由于超聲波的機械作用能夠破壞蛋白質結構，暴露更多蛋白酶結合位點，促進蛋白酶解。可是過高的超聲功率、過長的超聲時間會進一步破壞蛋白酶結合位點和蛋白酶自身結構，使得蛋白酶活性下降，影響酶解效果，從而降低水解率[42]。同樣，過高的超聲溫度也會破壞蛋白酶活性，所以適當升高超聲溫度才有利于蛋白水解度的提高。研究表明，蛋白質水解度與其抗氧化活性有一定關系，但不呈正相關[43-44]。因此，有效控制超聲預處理條件和酶解工藝，才能獲得適宜水解度的高抗氧化活性酶解產物。

超聲預處理后大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的游離巰基含量較未經超聲預處理樣品有顯著升高。據報道，高靜水壓力會使大米蛋白結構部分展開，促使大米蛋白酶解物的游離巰基含量顯著升高[45]。與之相似，超聲-酶水解復合改性會使大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白結構疏松，水解度增大，酶解產物聚合度下降，蛋白質二級結構展開，包埋在蛋白質內部的巰基暴露出來，增加體系游離巰基的含量[46]。

經超聲預處理后的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的抗氧化活性顯著提高（P＜0.05）。酶解物抗氧化活性提高的可能原因是超聲波的空化效應使液體中產生氣泡，氣泡被擠壓破裂后，瞬間產生強大的物理剪切力，這種作用力可以使蛋白質的結構改變，促使某些基團與酶切位點暴露出來，有利于和堿性蛋白酶的結合，水解得到具有較高抗氧化活性的肽段。超聲預處理導致酶解物的空間構象改變，使得氨基酸基團與自由基接觸變得容易，更多的電子與自由基未成對電子配對，使得羥自由基清除率有所增加。同時，酶解物結構上的改變，也使得抗氧化活性氨基酸更易與反應體系中Fe2+結合，組氨酸上的α-氨基和羧基與Fe2+形成五元環，α-氨基和咪唑基與Fe2+形成六元環，羧基和咪唑基與Fe2+形成七元環，Fe2+與組氨酸生成穩定的螯合物，提高了Fe2+的螯合能力[40]。

綜上所述，超聲-酶解復合改性是簡單有效的蛋白質改性方法。在超聲作用下，蛋白質結構的次級鍵和二硫鍵斷裂，蛋白質二級、三級結構展開，緊密度下降。因此，超聲預處理后，蛋白質聚集度下降，空間結構更加疏松，活性基團暴露，蛋白酶與底物結合位點增多，酶解反應更易進行，進而實現高抗氧化活性大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的制備。

3 結 論

本研究采用超聲-酶解復合改性的方法，利用堿性蛋白酶，對大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白進行酶解，并對其結構和抗氧化性進行初步分析和表征，主要結論如下：

傅里葉變換紅外光譜表征發現在超聲波空穴作用下，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物中α-螺旋和β-轉角結構含量明顯升高，而無規卷曲和β-折疊結構含量明顯降低，說明蛋白質分子發生解聚和重排，使其二級結構含量發生變化，疏水相關位點暴露。另外，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的熒光峰強和紫外峰強明顯增加也進一步說明酶解物三級結構展開，包埋在蛋白質內部的疏水活性基團暴露出來[35,41]，這對提高酶解物的抗氧化活性有積極意義。

超聲預處理暴露酶解活性位點，有效提高酶解效率，使蛋白酶解物的水解度和游離巰基的含量較未處理樣品大大升高。

超聲預處理后，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的還原能力、羥自由基清除能力和Fe2+螯合能力均有顯著提高，為大豆蛋白高效酶解改性提供技術參考和理論依據。