黑靈芝多糖對脂多糖誘導巨噬細胞M1/M2表型轉化的影響

劉 想，付王威，牛曉琴，顏雨新，張賢益，李文娟,*

（1.南昌大學醫學院，江西 南昌 330008；2.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

巨噬細胞是全身或局部炎癥反應的關鍵效應細胞。炎癥狀態下，外周血單核細胞進入組織分化形成巨噬細胞，其可通過分泌細胞因子及抗原提呈等作用影響并調控免疫炎癥反應的進程[1-2]。在不同激活方式的刺激下，巨噬細胞可表現出不同的免疫表型及功能，主要包括經典活化型巨噬細胞（M1型）和替代活化型巨噬細胞（M2型）兩類。M1和M2型巨噬細胞可動態調節免疫炎癥反應過程中的天然免疫應答[3]。在炎癥反應初期，多介質誘導M1型巨噬細胞數量增加，有利于病原微生物的清除；隨著炎癥反應進展，M2型巨噬細胞比例逐漸增加，促進炎癥損傷的修復[4]。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是全身炎癥反應綜合征的一種重要致病因子。其通過與各種免疫細胞表面相應的模式識別受體相結合而進入細胞，繼而激活多條炎癥通路，產生一系列促炎因子，引起機體嚴重的炎癥反應[5-6]。有趣的是，LPS所介導的炎癥反應中存在M1/M2型巨噬細胞分化的失衡，表現為促炎型M1型細胞增多，而抗炎型M2型細胞減少[7]。由此，通過調控炎癥型M1型巨噬細胞向抗炎型M2型巨噬細胞的轉化有助于改善LPS介導的炎癥反應，可為炎癥的防治提供新思路。

黑靈芝（Ganoderma atrum）是我國江西省贛南地區的一種特色資源，其作為藥物和功能食品已有兩千余年的應用歷史，但迄今為止，有關其活性組分的研究國內外鮮有報道[8]。本實驗室前期對黑靈芝的活性組分——多糖進行了分離純化，得到的一種水溶性多糖，命名為PSG-1。活性功能研究證實黑靈芝多糖具有免疫調節、抗衰老和抗腫瘤等多種生物學活性[9]。同時，研究發現在LPS致炎巨噬細胞中，黑靈芝多糖可顯著抑制LPS介導的NO和白細胞介素（interleukin，IL）-1β的過度釋放，具有抗炎作用[10]。然而，黑靈芝多糖是否可調控促炎型M1型巨噬細胞轉向抗炎型M2型巨噬細胞，并由此途徑改善LPS介導的炎癥反應，仍需進一步闡明。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

清潔級別的昆明小鼠，雌雄不限，體質量（20.00±2.00）g，購自江西中醫藥大學實驗動物科技中心，生產許可證號：SCXK（贛）2006-0001，動物合格證號：SCXK（贛）2005-0001，所購昆明小鼠飼養于南昌大學醫學院實驗動科部（使用許可證：SCXK（贛）2015-0001）。

黑靈芝多糖為本實驗室自行制備[9]。

DMEM 美國GIBCO公司；胎牛血清 杭州四季青生物工程有限公司；中性紅 國藥集團化學試劑有限公司；FITC-大鼠抗小鼠甘露糖受體（mannose receptor，MR：CD206） 英國AbDSerotec公司；抗MR抗體 美國Abcam公司；細胞因子IL-1β試劑盒上海申雄科技實業有限公司；細胞因子IL-10試劑盒武漢博士德生物工程有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒、二喹啉甲酸蛋白濃度測定試劑盒和NO試劑盒 碧云天生物技術研究所。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺 蘇州凈化設備廠；二氧化碳培養箱日本TOSHIBA公司；倒置顯微鏡 日本OLYMPUS公司；752紫外分光光度計、MD-200-3型電子天平 上海第三分析儀器廠；3K15-高速冷凍離心機 美國Sigma公司；FACSCaliburTM流式細胞儀 美國Becton Dickinson公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠腹腔來源巨噬細胞的分離培養

小鼠頸椎脫臼處死后，立即浸泡于碘伏中并迅速移入細胞培養超凈臺，保持無菌狀態靜置5 min；隨后將小鼠浸入體積分數75%乙醇3 min，用眼科彎鑷取出小鼠并放置于醫用搪瓷彎盤中；止血鉗鈍性分離小鼠腹部皮膚，暴露腹壁并向腹腔內注入4～5 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），輕揉小鼠腹部2 min左右；用眼科剪于小鼠側腹壁下方（左右均可）剪一約3 mm左右的小口，注射器吸取腹腔液并移入離心管中。合并腹腔液，1 000×g離心8 min并棄上清液，收集細胞沉淀并采用含血清DMEM完全培養基重懸。臺盼藍拒染法計數活細胞比例大于95%的前提下，應用完全培養基調整細胞濃度并分別接種于96 孔培養板和6 孔培養板中，最后將培養板放置于二氧化碳細胞培養箱中，4 h后取出培養板，換液并棄去未貼壁的細胞，即得到小鼠腹腔巨噬細胞。

1.3.2 LPS誘導小鼠腹腔巨噬細胞炎癥模型的建立與實驗分組

原代培養純化的小鼠腹腔巨噬細胞，隨機分為4 組，每個處理組設置4 個復孔。1）對照組：腹腔巨噬細胞中給予等體積的含血清完全培養基；2）LPS組：腹腔巨噬細胞中給予相同體積的完全培養基，24 h后給予LPS（1 μg/mL）刺激24 h；3）PSG-1（40、80、160 μg/mL）+LPS組：本實驗室PSG-1的劑量選擇40、80、160 μg/mL預處理腹腔巨噬細胞24 h后，加入LPS（1 μg/mL）刺激24 h，全程給予PSG-1；4）抗MR抗體+LPS+PSG-1：加入抗MR抗體（10 μg/mL）孵育巨噬細胞30 min后，再加入PSG-1（160 μg/mL）處理24 h，最后加入LPS（1 μg/mL）刺激24 h，全程給予PSG-1和抗MR抗體。

1.3.3 中性紅檢測巨噬細胞吞噬活性

按組分別收集小鼠腹腔巨噬細胞，3 000 r/min離心3 min后吸去上清液，PBS洗滌沉淀細胞2 次。收集細胞接種于培養孔中，加入中性紅溶液培養4 h，離心去除上清液并用PBS洗滌3 次。在每孔中加入1 mL細胞裂解液，在室溫下放置2～3 h以完全裂解細胞。在多功能酶標儀上測定540 nm波長處的吸光度（A540nm）[11]。

1.3.4 流式細胞儀檢測細胞內ROS水平

按組分別收集小鼠腹腔巨噬細胞，3 000 r/min離心3 min后吸去上清液，PBS洗滌沉淀細胞2 次。加入0.5 mL DCFH-DA溶液（10 μmol/L）重懸細胞，避光37 ℃孵育20 min后，3 000 r/min離心3 min，棄上清液，PBS洗滌2 次，用流式細胞儀檢測細胞內7’-二氯熒光素（7’-dichlorofluorescein，DCF）的熒光強度，以DCF的熒光強度來反映細胞內ROS的含量[12]。

1.3.5 Griess法測定NO的生成

按組分別收集小鼠腹腔巨噬細胞培養上清液。按照NO檢測試劑盒方法檢測小鼠腹腔巨噬細胞培養上清液中的NO含量。

1.3.6 ELISA法測定細胞因子生成

采用酶聯免疫吸附測定法（e nzyme-l i nke d immunosorbent assay，ELISA）檢測細胞培養上清液中細胞因子（IL-1β和IL-10）質量濃度。應用多功能酶標儀在492 nm波長處測定吸光度（A492nm），根據標準曲線計算出實驗樣本中細胞因子的質量濃度。

1.3.7 流式細胞儀檢測巨噬細胞MR表達

按組分別收集小鼠腹腔巨噬細胞，3 000 r/min離心3 min后吸去上清液，PBS洗滌沉淀細胞2 次后加100 μL PBS重懸細胞；加入10 μL FITC標記的大鼠抗小鼠CD206抗體檢測巨噬細胞MR的表達，同型對照管加入10 μL對照試劑FITC-IgG2a。4 ℃條件下避光培養30 min后，PBS洗滌2 次以去除未結合的抗體；重懸細胞液定量至0.5 mL左右，應用流式細胞儀檢測并記錄各組MR的熒光強度[13]。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 PSG-1對LPS誘導小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響

圖 1 PSG-1對LPS誘導的巨噬細胞吞噬中性紅能力的影響Fig. 1 Effect of PSG-1 on neutral red phagocytosis by LPS-induced macrophages

小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅實驗結果（圖1）表明，與對照組相比，LPS對正常小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性有明顯的增強作用。在細胞培養液中加入不同質量濃度的PSG-1后，與LPS組相比，小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性顯著下降，實驗結果表明PSG-1能顯著抑制LPS誘導小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力增強。

2.2 PSG-1抑制LPS誘導的巨噬細胞向M1表型極化

圖 2 PSG-1對LPS處理的小鼠腹腔巨噬細胞向M1表型極化的影響Fig. 2 Effect of PSG-1 on M1 polarization of LPS-induced mouse peritoneal macrophages

M1型巨噬細胞可高分泌細胞因子IL-1β和NO等，并可促進ROS的產生，參與炎癥反應及病菌清除，體內產生過量促炎因子時即導致有害的炎癥損傷發生[14]。本實驗發現，與對照組相比，LPS組中的小鼠腹腔巨噬細胞培養液中IL-1β（圖2A）和NO（圖2B）的水平顯著增加，腹腔巨噬細胞中ROS（圖2C、D）的生成量亦顯著升高。實驗結果表明LPS可誘導小鼠腹腔巨噬細胞向M1型極化。而與LPS組相比，在細胞培養液中加入不同質量濃度的PSG-1后，小鼠腹腔巨噬細胞中IL-1β、NO和ROS的水平顯著下降，表明PSG-1能抑制LPS對小鼠腹腔巨噬細胞向M1型極化的誘導。

2.3 PSG-1促進LPS誘導的巨噬細胞向M2表型極化

圖 3 PSG-1對LPS處理的小鼠腹腔巨噬細胞向M2表型極化的影響Fig. 3 Effect of PSG-1 on M2 polarization of LPS-induced mouse peritoneal macrophages

IL-10和MR作為M2型巨噬細胞的特征性參數，常用于M2型巨噬細胞極化的研究中。M2型巨噬細胞可表現為IL-10的高分泌和MR的高表達[15]。本實驗結果表明，與對照組相比，LPS組小鼠腹腔巨噬細胞培養上清液中IL-10的水平顯著增加（圖3A）；熒光探針FITC-MR標記小鼠腹腔巨噬細胞，可發現MR的熒光強度顯著下降（圖3B、C）。與LPS組相比，PSG-1處理可顯著性上調LPS誘導的巨噬細胞中MR的表達與IL-10的水平。這些數據提示PSG-1在抑制LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞向M1型極化的同時，促進巨噬細胞向M2型極化。

2.4 PSG-1通過MR調控LPS誘導的巨噬細胞向M1/M2表型轉化

圖 4 PSG-1通過MR調控LPS誘導的巨噬細胞M1/M2表型轉化Fig. 4 Effect of PSG-1 on M1/M2 polarization of mouse peritoneal macrophages via MR

將中性紅溶液加入小鼠巨噬細胞培養上清液中，通過檢測培養液的吸光度來反映巨噬細胞的吞噬活性。吞噬結果發現（圖4A），應用抗MR抗體預處理后，與LPS+PSG-1組相比，巨噬細胞的吞噬能力有所上升，即PSG-1對于LPS所介導的巨噬細胞吞噬增強的抑制作用顯著下降，表明PSG-1是通過MR顯著抑制LPS激活的小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能。同時，抗MR抗體處理也可阻斷PSG-1對小鼠腹腔巨噬細胞的M1/M2炎癥表型分化的調控。如圖4B～F所示，與LPS+PSG-1組相比，抗MR抗體可顯著上調NO、IL-1β和ROS的生成，由此阻斷PSG-1對巨噬細胞M1表型極化的抑制。觀察抗MR抗體對IL-10的分泌的影響可以發現（圖4D），與LPS+PSG-1組相比，抗MR抗體預處理組中IL-10的分泌顯著下降，由此提示抗MR抗體可抑制巨噬細胞的M2型極化。

3 討 論

巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，其極化模式的調控對維系健康十分重要，相關研究也已成為新的熱點[16]。本實驗應用LPS建立體外炎癥模型，研究PSG-1對LPS介導巨噬細胞極化模式的影響。實驗結果表明PSG-1具有抗炎作用，其機理與PSG-1通過促進LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞中MR的表達，進而抑制巨噬細胞的M1型極化而促進巨噬細胞的M2型極化密切相關。

在多種炎性疾病的發生發展過程中均存在著巨噬細胞的極化現象。基于巨噬細胞較高的可塑性和異質性，在不同的組織微環境下，巨噬細胞可向M1和M2兩種類型極化[17]。M1型巨噬細胞表現為高分泌IL-1β和NO等炎性細胞因子，并促進ROS的產生[14]。IL-1β是一種由活化的巨噬細胞所產生的細胞因子，在刺激免疫細胞增殖、分化中起重要作用。過量的IL-1β可誘導炎癥反應發生并促進炎性細胞因子的釋放，導致多種臟器發生損傷。NO是一種重要的活性介質，炎癥反應過程分泌的IL-1β可誘導其過量產生，從而進一步加重炎癥反應[18]。ROS是細胞有氧代謝的副產物，主要包括過氧化物和氧自由基。在炎癥反應中，炎癥細胞發生呼吸爆發產生大量氧自由基，導致組織細胞壞死凋亡，加重炎性反應[19]。本實驗結果顯示，小鼠腹腔巨噬細胞給予LPS后，與對照組相比，LPS組的小鼠腹腔巨噬細胞培養液中IL-1β和NO的水平顯著增加，ROS生成亦顯著升高，表明LPS誘導的巨噬細胞呈現出M1表型極化。與LPS組相比，PSG-1組小鼠腹腔巨噬細胞中IL-1β、NO和ROS的水平顯著下降，由此表明PSG-1可抑制LPS介導的巨噬細胞向M1型極化。研究證實，IL-10的高分泌和MR的高表達常常被用于M2型巨噬細胞極化研究[15]。IL-10是一種抗炎細胞因子，其在控制炎癥反應的發展中有著至關重要的作用[18]。本實驗結果顯示，與LPS組相比，PSG-1顯著性上調LPS誘導的巨噬細胞中IL-10的水平，因此推測PSG-1可促進LPS誘導的腹腔巨噬細胞向M2型極化。巨噬細胞的極化方向可有效反映機體局部組織的炎癥狀態。對巨噬細胞極性分化的深入探索，并通過調控炎性疾病中的極化失衡狀態將有望開拓新的免疫相關疾病的治療方法[20]。

此外，本實驗結果還發現PSG-1在發揮調控LPS誘導的巨噬細胞M1/M2表型轉化作用的同時，還可促進MR的表達。MR是最早在巨噬細胞上被發現的一類非Toll樣模式識別受體，是一種分子質量為175 kD的糖蛋白，屬于C型植物凝集素家族[21]。作為先天性免疫和后天性免疫的橋梁，MR在巨噬細胞極化過程中發揮重要作用。研究發現，在M2型巨噬細胞中MR呈現特征性上調，因而被作為M2型巨噬細胞的標記物[22]。本實驗發現PSG-1在發揮抗炎作用的同時，能顯著增加MR的表達。應用抗MR抗體處理后，PSG-1對LPS誘導的巨噬細胞極化模式調控作用減弱，抗炎作用顯著降低。這些實驗數據均提示PSG-1抑制LPS介導巨噬細胞向M1極化與MR有關。

近年來，越來越多的研究證實多糖激活免疫細胞發揮免疫調節作用主要是通過與細胞表面的模式識別受體（包括MR）相結合而介導的[23-24]。MR胞外段結構包括富含半胱氨酸區域，II型纖連蛋白重復區和8～10 個C型凝集素樣糖類識別域。MR結構中的糖類識別區域，可識別并結合以D-甘露糖、L-巖藻糖和N-乙酰葡萄糖胺等糖殘基為末端的糖類物質[25-27]。在免疫研究中，MR無疑是一個新的設計靶標，并以此推動以甘露糖為結構基礎的多糖免疫調節研究[28]。有趣的是，黑靈芝多糖的結構表征數據顯示甘露糖是黑靈芝多糖的主要單糖組分[29]。因此本實驗結果提示PSG-1對LPS誘導巨噬細胞M1/M2表型極化的調控與其結構密切相關，可能與PSG-1結構中甘露糖單糖組成有關。黑靈芝多糖與MR之間結構與生物活性的關聯，可為黑靈芝多糖研究確立新的分子靶點。此外，在以后的研究中，將從巨噬細胞極化出發，進一步探討黑靈芝多糖對極化相關信號通路的調控及機制。