巴馬長壽飲食模式在衰老小鼠模型中的抗氧化應(yīng)激效果

宋 奇，艾連中，魯紅巖，郝 丹，陳 燏，孫 薈，蘭海靜，張祖韜，李全陽,*

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；3.廣西石埠乳業(yè)有限責(zé)任公司，廣西 南寧 530021）

衰老是極復(fù)雜的過程，受遺傳因素和環(huán)境因素的共同影響。自由基損傷學(xué)說是解釋衰老的理論之一，其認(rèn)為自由基和活性氧在機(jī)體內(nèi)的堆積會導(dǎo)致細(xì)胞和組織的損傷，造成氧化應(yīng)激并引起衰老和不正常的細(xì)胞死亡[1]。實(shí)際上，有研究表明老年性疾病和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生也伴隨著氧化應(yīng)激[2]，因此機(jī)體氧化應(yīng)激水平，如丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、抗氧化酶活力等，也成為衡量抗衰老的重要指標(biāo)[3]，而降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平、維持氧化還原平衡對人們健康長壽也有著重要意義[4]。在衰老研究方面，因為高劑量的D-半乳糖難以完全代謝造成其在機(jī)體內(nèi)的蓄積，進(jìn)而誘導(dǎo)體內(nèi)氧化應(yīng)激，可以模擬小鼠的自然衰老，嚙齒類動物長期注射D-半乳糖也成為抗衰老研究的動物模型[5]，同時其也廣泛應(yīng)用于健康食品的檢測。

飲食是對衰老影響最大的環(huán)境因素之一[6]。世界衛(wèi)生組織和美國疾病控制預(yù)防中心預(yù)估，健康的飲食能有效預(yù)防冠心病、II型糖尿病、心血管疾病和癌癥等老齡化疾病的發(fā)生[7-8]。對飲食營養(yǎng)和健康長壽的研究也表明，合理的飲食能有效延緩衰老[9]，如地中海飲食能有效降低心血管疾病和癌癥的發(fā)生風(fēng)險[10]。此外，飲食干預(yù)如能量限制等，也被證明是改善模型動物衰老特征、延長壽命強(qiáng)有力的手段[11-12]。而對長壽地區(qū)飲食營養(yǎng)的研究也表明，長壽地區(qū)的飲食結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)特征對當(dāng)?shù)厝巳旱慕】甸L壽有著積極作用[13-14]。

廣西河池巴馬縣是世界知名的長壽之鄉(xiāng)，長壽現(xiàn)象凸顯。根據(jù)2010年中國第6次人口普查資料顯示[15]，巴馬縣的百歲人口比例達(dá)到36.50/10萬 人，遠(yuǎn)高于聯(lián)合國對長壽鄉(xiāng)的定義標(biāo)準(zhǔn)（百歲人口比例7.50/10萬 人）[16]。在巴馬地區(qū)長壽現(xiàn)象的研究中，對遺傳因素和地理環(huán)境因素的探索報道較多，本課題組著眼于飲食營養(yǎng)、腸道微生態(tài)和代謝組學(xué)分析，前期研究中已對巴馬長壽地區(qū)的飲食進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其是以粥類、玉米、大豆等粗雜糧類、深色蔬菜類、家畜肉類食物攝入為主的膳食纖維多糖飲食模式[17-18]；對飲食營養(yǎng)特征的調(diào)查也表明，高膳食纖維含量、高VA含量和低能量的攝入特征有助于長壽[19]；對巴馬百歲老人代謝特征、指甲和飲水中的元素特征及其與營養(yǎng)素攝入水平的相關(guān)性分析表明，能量限制、VA、膳食纖維和鐵、錳、鈷、硒等微量元素的較高攝入量是巴馬長壽老人飲食中具有代表性的營養(yǎng)特征，可能與延緩衰老密切相關(guān)[20-21]。在上述研究的基礎(chǔ)上，試圖建立幾種巴馬長壽飲食模式，并利用動物模型加以驗證，以期從飲食的角度探索長壽現(xiàn)象的形成。

為此，本研究選取巴馬長壽老人飲食中的特征營養(yǎng)素和營養(yǎng)特征，以D-半乳糖致衰老小鼠為研究對象，通過對小鼠生長特性和氧化應(yīng)激水平的初步評估，以期探究巴馬長壽飲食模式在延緩衰老中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

8 周齡SPF級雄性昆明小鼠84 只，體質(zhì)量（36±2）g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心（實(shí)驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（桂）2014-002），飼養(yǎng)溫度控制在（24±2）℃，相對濕度（60±10）%，12 h晝夜交替，自由飲食飲水。

基礎(chǔ)飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，符合GB 13078—2017《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》和GB 14924.3—2010《實(shí)驗動物 配合飼料營養(yǎng)成分》；β-胡蘿卜素 南京都萊生物技術(shù)有限公司；大豆異黃酮 上海源葉生物科技有限公司；大豆膳食纖維 平頂山金晶生物科技有限公司；玉米膳食纖維 楊凌慈緣生物技術(shù)有限公司；D-半乳糖 合肥新恩源生物技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒、MDA試劑盒、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）試劑盒 南京建成生物研究所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

超微粉碎機(jī) 浙江省溫嶺市創(chuàng)力藥材機(jī)械廠；JRA-2數(shù)顯磁力攪拌水浴鍋 金壇市科杰儀器廠；Pico17低溫冷凍離心機(jī) 美國Thermo Scientific公司；TG16W微量高速離心機(jī) 長沙平凡儀器儀表有限公司；WGL-125B電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；METASH UV-5200紫外-可見分光光度計上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 飼料的設(shè)計及制備

將基礎(chǔ)飼料打粉，以此為基礎(chǔ)設(shè)計特征飼料并制備成粒。依據(jù)本課題組前期研究結(jié)果，并參考齊廣海等[22]的方法，特征飼料及配方如下：胡豆飼料在基礎(chǔ)飼料中添加一定量的β-胡蘿卜素和4.0 g/kg大豆異黃酮；纖維飼料在基礎(chǔ)飼料中添加一定量的大豆膳食纖維和玉米膳食纖維；元素飼料在基礎(chǔ)飼料中添加一定量的硒、鐵、錳、鈷元素，硒元素以亞硒酸鈉形式添加，其他元素均以硫酸鹽形式添加；復(fù)合飼料在基礎(chǔ)飼料中綜合添加一定量的β-胡蘿卜素、大豆異黃酮、大豆膳食纖維和玉米膳食纖維，同時添加硒、鐵、錳、鈷元素，大豆異黃酮添加量為1.0 g/kg。各飼料具體營養(yǎng)成分見表1。

表 1 基礎(chǔ)飼料及特征飼料的營養(yǎng)成分Table 1 Nutrient contents of basic diet and characteristic diets

1.3.2 動物分組及處理

84 只小鼠隨機(jī)分為7 組，每組12 只，分為年輕組、衰老組、能限組、胡豆組、纖維組、元素組和復(fù)合組。參考Rehman等[23]的造模方法，除年輕組外，其余6 組每日上午頸背部皮下注射500 mg/kg D-半乳糖，年輕組注射等體積生理鹽水，持續(xù)8 周。造模同時，各組開始給予相應(yīng)處理，年輕組和衰老組飼喂基礎(chǔ)飼料，不限進(jìn)食；能限組飼喂基礎(chǔ)飼料，參考劉天娥等[24]的方法，限制30%進(jìn)食；胡豆組、纖維組和元素組分別飼喂胡豆飼料、纖維飼料和元素飼料，不限進(jìn)食；復(fù)合組飼喂復(fù)合飼料，限制10%進(jìn)食。各組小鼠自由飲水，連續(xù)飼喂8 周，每周稱質(zhì)量一次，每日上午記錄進(jìn)食量。

1.3.3 樣品采集和處理

飼喂期結(jié)束后，所有小鼠禁食、禁水12 h，稱體質(zhì)量，麻醉后摘眼球取血，所采集的血液在4 ℃下靜置，待血清析出后，在高速離心機(jī)中4 ℃、3 000 r/min離心15 min，保留上清液并分裝，保存于-80 ℃下。

取血后，麻醉小鼠迅速脊椎脫臼處死，冰上取出心臟、肝臟、脾臟、腎臟和腦組織，去除脂肪和肌膜后用冰生理鹽水漂洗、濾紙吸干、稱質(zhì)量，并迅速凍存于-80 ℃。檢測當(dāng)日，取出肝臟和腦組織，稱質(zhì)量，加入9 倍體積的生理鹽水，使用勻漿器在冰水浴中勻漿，制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的組織勻漿，并于4 ℃下以3 000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)行檢測。

1.3.4 臟器系數(shù)和生化指標(biāo)的檢測

臟器系數(shù)按以下公式計算。

式中：m1為小鼠臟器質(zhì)量/g；m2為小鼠體質(zhì)量/g。

按試劑盒說明書，分別對血清中的MDA濃度和T-SOD活力、肝臟組織中的組織蛋白質(zhì)量濃度、MDA含量和T-AOC、腦組織中的組織蛋白質(zhì)量濃度、MDA含量、T-AOC和T-SOD活力進(jìn)行檢測。并對其結(jié)果進(jìn)行綜合量化評價。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本實(shí)驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果表示為±s，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示兩組數(shù)值間差異顯著，P＜0.01表示兩組數(shù)值間差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 特征飲食對小鼠體質(zhì)量的影響

表 2 特征飲食對D-半乳糖致衰老小鼠體質(zhì)量的影響Table 2 Effects of characteristic diets on body mass of D-galactose-induced aging mice

小鼠體質(zhì)量的增長是反映小鼠生長發(fā)育情況的重要指標(biāo)[25]。由表2可知，實(shí)驗開始時各組小鼠的體質(zhì)量為（36±2）g，各組之間沒有顯著差異（P＞0.05）。實(shí)驗結(jié)束時，與年輕組相比，衰老組、纖維組、胡豆組、元素組和復(fù)合組小鼠體質(zhì)量差異不顯著（P＞0.05）；與衰老組相比，能限組和胡豆組小鼠的體質(zhì)量顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）。在體質(zhì)量總增長量上，衰老組和年輕組小鼠間差異不顯著（P＞0.05），表明長期注射D-半乳糖對小鼠體質(zhì)量的增長無顯著影響；與年輕組和衰老組相比，能限組小鼠體質(zhì)量均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），說明能量限制能顯著抑制體質(zhì)量的增長；其他特征飲食組的體質(zhì)量增長差異不顯著。Lemon等[26]的研究證明，給予轉(zhuǎn)基因生長激素小鼠一定劑量的復(fù)合膳食補(bǔ)充劑不會對小鼠的體質(zhì)量增長造成不良影響。本研究發(fā)現(xiàn)特征飲食的飼喂也未對D-半乳糖致衰老小鼠的體質(zhì)量增長產(chǎn)生顯著影響，說明特征飲食對D-半乳糖致衰老小鼠的生長發(fā)育無顯著的不良作用。

2.2 特征飲食對小鼠臟器系數(shù)的影響

表 3 特征飲食對D-半乳糖致衰老小鼠臟器系數(shù)的影響Table 3 Effects of characteristic diets on organ coef ficients of D-galactose-induced aging mice%

實(shí)驗動物的臟器系數(shù)是動物主要的生物學(xué)特性之一，能反映動物的整體營養(yǎng)情況以及器官病變程度，而腦、肝臟、腎臟等重要臟器的萎縮也是衰老的重要宏觀表現(xiàn)之一[27]。由表3可知，與年輕組相比，衰老組小鼠各項臟器系數(shù)均有所下降，但差異不顯著（P＞0.05）。與衰老組相比，特征飲食各組的心臟系數(shù)、肝臟系數(shù)、腎臟系數(shù)、脾臟系數(shù)和腦系數(shù)均有一定程度提高，尤其是能限組小鼠的腦系數(shù)極顯著升高了18.18%（P＜0.01）；胡豆組小鼠的肝臟系數(shù)極顯著升高了17.85%（P＜0.01），脾臟系數(shù)顯著升高了47.06%（P＜0.05）；復(fù)合組小鼠的脾臟系數(shù)顯著升高了41.17%（P＜0.05）。王馳等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，灌胃富硒玉米肽能顯著提高老齡小鼠的胸腺指數(shù)，這可能與機(jī)體抗氧化酶活力提高有關(guān)。而本研究結(jié)果也表明，5 種特征飲食均有延緩衰老小鼠臟器退化的作用，其機(jī)理可能與清除自由基、提高抗氧化酶活力有關(guān)。

2.3 特征飲食對小鼠T-SOD活力的影響

圖 1 特征飲食對D-半乳糖致衰老小鼠血清（a）和腦組織（b）中T-SOD活力的影響Fig. 1 Effects of characteristic diets on T-SOD activity in serum (a)and brain (b) of D-galactose-induced aging mice

由圖1可知，與年輕組相比，衰老組小鼠在長期注射D-半乳糖的作用下，血清和腦組織中T-SOD活力分別降低了18.90%（P＜0.01）和17.15%（P＜0.05），表明衰老小鼠模型建立成功。經(jīng)飲食干預(yù)以后，與衰老組相比，特征飲食各組小鼠血清和腦組織中T-SOD活力均有一定程度的提高，尤其是纖維組和復(fù)合組小鼠血清中的T-SOD活力分別提高了19.98%（P＜0.01）和12.33%（P＜0.05）。自由基是生物體氧化磷酸化過程的副產(chǎn)物，機(jī)體的衰老與自由基在機(jī)體內(nèi)的動態(tài)平衡緊密相關(guān)[29]。自由基的清除依賴于機(jī)體防御體系抗氧化能力的強(qiáng)弱，SOD是機(jī)體內(nèi)極為重要的自由基清除劑和抗氧化酶，能催化超氧化物通過歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫，清除氧自由基從而保護(hù)細(xì)胞[30-31]。研究表明，T-SOD活力可以反映機(jī)體清除自由基的能力，是評價實(shí)驗動物衰老的重要指標(biāo)之一[32-33]。葉靜等[34]的研究發(fā)現(xiàn)灌胃200 mg/kg燕麥膳食纖維能使衰老小鼠血清T-SOD提高12.19%，稍低于本研究中復(fù)合組的效果，表明融合了多種巴馬長壽老人飲食營養(yǎng)特征的復(fù)合飲食對D-半乳糖誘導(dǎo)的氧化損傷有良好的作用效果，能明顯減緩機(jī)體內(nèi)的氧化損傷程度。

2.4 特征飲食對小鼠T-AOC的影響

圖 2 特征飲食對D-半乳糖致衰老小鼠肝臟（a）和腦組織（b）中T-AOC的影響Fig. 2 Effects of characteristic diets on T-AOC activity in liver (a) and brain (b) of D-galactose-induced aging mice

圖2顯示，飲食干預(yù)以后，與年輕組相比，衰老組小鼠肝臟和腦組織中T-AOC分別降低了23.36%（P＜0.05）和18.30%（P＜0.05），說明D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化能力遭到破壞。與衰老組相比，胡豆組、纖維組、元素組和復(fù)合組小鼠肝臟的T-AOC分別顯著提高了36.36%、33.33%、35.35%和35.35%（P＜0.05），特征飲食各組小鼠腦組織的T-AOC也都有一定程度的提高，纖維組小鼠腦組織的T-AOC提高了19.50%（P＜0.05）。

機(jī)體的T-AOC包括酶促體系和非酶促體系，是直接反映抗氧化水平的重要指標(biāo)[35]。T-AOC的降低是衰老過程中重要的生理學(xué)變化，與機(jī)體的健康密切相關(guān)[36]。徐紅艷等[37]的研究也表明，D-半乳糖衰老模型造模成功的標(biāo)志之一是T-AOC和抗氧化酶活力的顯著降低。此外，有研究表明維生素、大豆異黃酮和膳食纖維的攝入對提高衰老小鼠機(jī)體T-AOC有重要作用[38-40]。王艷紅等[41]的研究表明，灌胃衰老小鼠75 mg/kg馬栗提取物能使小鼠肝臟T-AOC提高17.6%，低于本研究中復(fù)合組的效果（35.35%），表明結(jié)合多種巴馬長壽老人飲食營養(yǎng)特征的復(fù)合飲食能有效預(yù)防由氧化應(yīng)激導(dǎo)致的氧化損傷。

2.5 特征飲食對小鼠MDA水平的影響

表 4 特征飲食對D-半乳糖致衰老小鼠血清、肝臟和腦組織中MDA水平的影響Table 4 Effects of characteristic diets on MDA level in serum, liver and brain of D-galactose-induced aging mice

在T-SOD活力和T-AOC的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究了特征飲食對D-半乳糖致衰老小鼠血清、肝臟和腦組織中MDA水平的影響。從表4結(jié)果可知，經(jīng)過飲食干預(yù)以后，與年輕組相比，衰老組小鼠血清、肝臟和腦組織中MDA水平分別升高了37.48%（P＜0.01）、64.41%和57.02%（P＜0.05），表明D-半乳糖致衰老模型小鼠體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化加劇。與衰老組相比，特征飲食各組小鼠血清、肝臟和腦組織中MDA水平均有一定程度的降低，其中能限組小鼠血清和腦組織MDA水平分別降低了19.50%（P＜0.05）和45.79%（P＜0.01），胡豆組和元素組小鼠腦組織MDA水平分別降低了37.89%（P＜0.01）和32.10%（P＜0.05），纖維組小鼠血清和腦組織MDA水平分別降低了20.15%（P＜0.05）和38.42%（P＜0.01），復(fù)合組小鼠血清、肝臟和腦組織MDA水平分別降低了19.40%、39.18%和35.26%（P＜0.05）。

MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，機(jī)體產(chǎn)生的自由基會進(jìn)攻脂質(zhì)進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生MDA，因此MDA含量能直接反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化水平[42]。孫榮花等[43]的研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)8 周皮下注射0.5 g/kg D-半乳糖能使小鼠整體表現(xiàn)出衰老癥狀，包括腦組織MDA含量的提高。羅磊等[44]的研究發(fā)現(xiàn)，綠豆膳食纖維的攝入能使衰老小鼠肝臟MDA含量降低26.00%，低于本研究中復(fù)合組的效果（39.18%），表明結(jié)合多種巴馬長壽老人飲食營養(yǎng)特征的復(fù)合飲食能有效抑制脂質(zhì)過氧化水平，維持機(jī)體健康。目前鮮有巴馬長壽飲食在小鼠模型中作用的報道，而本實(shí)驗以D-半乳糖致衰老模型研究并驗證了巴馬長壽飲食模式在抗氧化應(yīng)激方面的作用，有助于解析長壽地區(qū)的飲食模式和延緩衰老間的聯(lián)系。

2.6 綜合量化評價結(jié)果

對上述5 種飲食模式參考李全陽等[45]的方法進(jìn)行綜合量化評價，以便更加直觀地反映不同模式的抗衰老效果，結(jié)果見表5。

表 5 5 種飲食模式綜合量化評價結(jié)果Table 5 Comprehensive evaluation of five dietary patterns

由表5可知，5 種模式的抗衰老效果排序為：復(fù)合組＞胡豆組＞能限組＞纖維組＞元素組。韓雪等[46]的研究發(fā)現(xiàn)，與單一抗氧化劑相比，復(fù)合抗氧化劑對小鼠清除自由基有更好的效果，這可能與抗氧化劑間的協(xié)同作用相關(guān)；Lemon等[26]的研究也表明，復(fù)合多種營養(yǎng)成分的膳食補(bǔ)充劑能更好地延緩老齡小鼠的衰老。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合組比其他4 種特征飲食組效果更好，說明這幾種特征營養(yǎng)素可能存在協(xié)同作用。巴馬長壽飲食模式對D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠機(jī)體有著顯著抗氧化作用，具有一定的開發(fā)潛力。

3 結(jié) 論

本研究以巴馬長壽老人飲食的特征營養(yǎng)素為基礎(chǔ)，設(shè)計5 種特征飲食模式，以D-半乳糖致衰老小鼠模型進(jìn)行驗證。結(jié)果表明，5 種特征飲食對D-半乳糖致衰老小鼠的生長發(fā)育均無不良影響，對小鼠血清、肝臟和腦組織的氧化應(yīng)激都有一定抗氧化作用。對比其余4 種特征飲食，結(jié)合多種巴馬長壽老人飲食營養(yǎng)特征的復(fù)合組飲食對衰老小鼠的血清、肝臟和腦組織MDA蓄積均有抑制作用，對肝臟MDA蓄積的抑制程度最強(qiáng)，能顯著提高肝臟

T-AOC和血清T-SOD活力，對機(jī)體的抗氧化應(yīng)激作用效果最好。對5 種模式進(jìn)行綜合量化評價，抗衰老效果排序為：復(fù)合組＞胡豆組＞能限組＞纖維組＞元素組。巴馬長壽老人飲食模式對機(jī)體抗氧化應(yīng)激有著積極作用，可能有助于機(jī)體健康，具有良好的開發(fā)潛力。