黑木耳多糖AAP-10對免疫抑制小鼠的免疫調節作用

甘 霓，許海林，吳小勇*，尹 輝，黃延盛，寧初光

（1.廣東藥科大學公共衛生學院，廣東 廣州 510310；2.廣東藥科大學食品科學學院，廣東 中山 528453；3.廣東藥科大學基礎學院，廣東 廣州 510006；4.無限極（中國）有限公司，廣東 新會 529156）

黑木耳（Auricularia auricula-judae）是一種大型食用真菌，是人工種植最早的商品菌類之一。目前我國黑木耳的年產量估計在300萬 t左右，黑木耳資源非常豐富。黑木耳的碳水化合物含量較高，一般占其子實體干質量的60%以上，且大部分為非淀粉多糖[1]。相關研究表明黑木耳多糖具有免疫調節、降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗凝血等多種藥理活性[2-7]，被認為是黑木耳的主要功能因子之一。

天然多糖作為一種生物大分子，在組成、結構方面存在多樣性；產地、菌種及提取、制備方法不同，得到的多糖在組成、結構方面會存在一定的差異，進而影響其生物活性[8-12]。本課題組的前期研究發現，產自浙江龍泉地區的一種黑木耳不僅多糖含量較高，且其粗多糖具有增強小鼠非特異性免疫的功效[13]。為進一步開發該黑木耳多糖，本研究采用分級醇沉的方法從該黑木耳中獲得水溶性多糖AAP-10，并重點研究了其對免疫抑制小鼠的免疫調節作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

近交系BALB/c小鼠，雌性，體質量18～22 g，合格證號：SCXK（粵）2013-0020，購自廣州中醫藥大學（大學城）實驗動物中心。

黑木耳產自浙江龍泉，由無限極（中國）有限公司提供。

水解蛋白酶（novozym37071） 諾維信（中國）生物技術有限公司；刀豆蛋白（concanavalin A，ConA）、噻唑藍（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、葡萄糖、甘露糖等單糖標準品 美國Sigma公司；DEAE-52纖維素柱、Sephacryl S-400凝膠柱、葡聚糖標準品（重均分子質量分別為670、270、80、25、12、5 kDa） 上海玉博生物科技有限公司；RPMI 1640培養基、新生牛血清 美國GIBCO公司；印度墨汁 上海億欣生物科技有限公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

752型紫外-可見分光光度計 上海棱光技術有限公司；1260高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；ELx808酶標儀 美國BioTek公司；CO2培養箱 上海安競實驗設備有限公司；BT100S/YZ15恒流泵 上海精科實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑木耳多糖的制備

取50.00 g粉碎過篩的黑木耳粉，按課題組前期優化得到的黑木耳多糖提取最佳工藝進行黑木耳多糖提取[13]，重復提取3 次，合并3 次提取液，適當濃縮后調節pH值至7.0，按底物質量的1%加入水解蛋白酶，于55 ℃下攪拌酶解12 h以分解提取液中的游離蛋白。酶解結束后沸水浴加熱保溫20 min，滅酶，向其中緩慢加入一定量的無水乙醇，直至體系中乙醇的質量分數達到10%，適當攪拌使乙醇分布均勻后置于4 ℃冰箱中醇沉12 h，4 000 r/min離心10 min，收集沉淀物，用蒸餾水將其完全溶解。先用流動自來水透析24 h，再用蒸餾水透析48 h，期間每12 h換一次水，截留液冷凍干燥，得到一種初步精制的黑木耳多糖，命名為AAP-10。準確稱質量，記錄AAP-10凍干粉的質量，以凍干粉質量與黑木耳粉質量之比計算黑木耳的多糖得率。

1.3.2 黑木耳多糖的纖維素柱層析和凝膠柱層析

準確稱取AAP-10凍干粉0.30 g，溶于100 mL蒸餾水中，取經0.45 μm濾膜過濾后的多糖溶液10 mL，過DEAE-52纖維素柱，用1.5 g/L NaCl溶液洗脫，洗脫劑流速為1.0 mL/min，自動部分收集器每5 min收集一管溶液，以苯酚-硫酸法跟蹤檢測多糖含量。以管號為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制APP-10過DEAE-52纖維素柱的洗脫曲線，收集并合并同一部分。取收集到的主要洗脫部分5.00 mL，直接過Sephacryl S-400凝膠柱，用1.5 g/L NaCl溶液洗脫，采用與DEAE-52纖維素柱類似操作，繪制AAP-10過Sephacryl S-400凝膠柱的洗脫曲線。

1.3.3 黑木耳多糖理化性質的測定

參照文獻[13]的方法，測定1.3.2節中配制好的AAP-10凍干粉水溶液（過濾膜前）的多糖含量，計算AAP-10的純度。采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生高效液相色譜法測定多糖的糖基組成[14]；以不同重均分子質量的葡聚糖為標準品，采用高壓凝膠滲透色譜法測定多糖的分子質量[15]。

1.3.4 動物實驗

取小鼠40 只，隨機分成5 組，分別為正常對照組、環磷酰胺（cyclophosphamide，CPA）模型組以及AAP-10低、中、高劑量給藥組，每組8 只。除正常對照組外，其余各組連續3 d每天按體質量80 mg/kg腹腔注射CPA，建立免疫低下小鼠模型。隨后，多糖給藥組每天灌胃給藥，根據前期研究結果，確定AAP-10低、中、高劑量組的多糖給藥量分別為2.5、5.0、10.0 mg/（kg·d），灌胃量均為0.2 mL/只，正常對照組和CPA模型組每天灌胃等體積的生理鹽水。期間每天定時測動物體質量，2 周后（第17天），各組隨機取一半動物進行相關指標檢測，另一半動物繼續灌胃2 周后（第31天）進行相關指標檢測。以臟器質量與體質量的比值表示臟器指數；采用MTT法通過ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化實驗檢測小鼠脾淋巴細胞轉化增殖能力[16-17]；通過小鼠碳廓清實驗檢測單核-巨噬細胞功能[18]；采用乳酸脫氫酶測定法檢測自然殺傷（natural killer，NK）細胞活性[19]。

1.4 數據統計分析

實驗數據均以 ±s表示，運用SPSS 22.0軟件，采用單因素方差分析對組間差異進行比較，組內比較采用t檢驗，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 AAP-10的基本理化性質分析

由50.00 g黑木耳子實體干粉得到4.47 g初步精制的AAP-10，多糖得率為8.94%。苯酚-硫酸法測得AAP-10的純度為97.58%，說明其純度較高；紫外-可見分光光度計掃描結果表明，AAP-10的水溶液在260、280 nm波長處都沒有吸收峰出現，說明多糖凍干粉中不含核酸和蛋白質。

圖 1 AAP-10過DEAE-52層析柱的洗脫曲線Fig. 1 Elution prof i le of AAP-10 on DEAE-52 column

圖 2 AAP-10過Sephacryl S-400凝膠柱的洗脫曲線Fig. 2 Elution prof i le of AAP-10 on Sephacryl S-400 column

從圖1可以看出洗脫曲線只有一個峰，說明AAP-10中多糖的性質較為接近。由圖2可知曲線只有一個單一對稱峰，說明黑木耳多糖AAP-10為分子質量分布較均一的多糖。糖基組成分析結果表明，AAP-10主要由葡萄糖和甘露糖組成，物質的量比為6∶1；分子質量分析結果表明，AAP-10的分子質量為6.56×105Da。

2.2 AAP-10給藥對免疫抑制小鼠體質量的影響分析

CPA是一種應用廣泛的化療藥物，屬于烷化劑類免疫抑制劑，常用于制備免疫抑制動物模型。一定劑量的CPA灌胃或注射，會引起動物體質量下降、免疫器官質量降低等生理反應[20]。從圖3可以看出，注射CPA后，小鼠體質量開始顯著下降，一直到第7天前后才開始停止下降并逐漸恢復，其中AAP-10中劑量組恢復得最快，CPA模型組及AAP-10高劑量組恢復得較慢。

圖 3 小鼠體質量變化情況Fig. 3 Changes in body mass ofmice from each group

表 1 AAP-10給藥對小鼠體質量的影響Table 1 Effect of AAP-10 administration on body mass of mice

從表1可以看出，在實驗第1天各組小鼠體質量無明顯差異；與正常對照組相比，在第17天，CPA模型組小鼠體質量顯著偏低（P＜0.05）；在第31天，CPA模型組和AAP-10高劑量組小鼠的體質量均極顯著低于正常對照組（P＜0.01），但AAP-10低、中劑量組小鼠體質量與正常對照組間差異不顯著。實驗結果說明，一定劑量的AAP-10給藥可改善CPA注射導致的小鼠體質量低于正常對照組的現象。

2.3 AAP-10給藥對免疫抑制小鼠臟器指數的影響

從表2可以看出，與正常對照組相比，CPA模型組及AAP-10給藥各組小鼠第17天的肝臟指數極顯著增大（P＜0.01）；AAP-10給藥各組小鼠第31天的肝臟指數與CPA模型組差異不明顯。CPA注射小鼠的體質量略低于正常小鼠（表1），可能是導致其的肝臟指數高于正常對照組的原因之一。

表 2 AAP-10給藥對小鼠臟器指數的影響Table 2 Effect of AAP-10 administration on liver index and spleen index of mice

CPA模型組小鼠的脾臟指數與正常對照組間差異不顯著；由于注射CPA會導致小鼠體質量下降，因此可以認為CPA注射導致了小鼠脾臟質量低于正常小鼠。AAP-10給藥各組小鼠第17天的脾臟指數與正常組相比均極顯著升高（P＜0.01），與肝臟指數的結果類似，推測與CPA注射導致小鼠的體質量略低于正常小鼠有關。與CPA模型組相比，在第17天，AAP-10給藥各劑量組小鼠的脾臟指數均極顯著增加（P＜0.01）；而在第31天，僅有AAP-10低劑量組小鼠脾臟指數極顯著增加（P＜0.01）。實驗結果表明，AAP-10給藥能在一定程度上升高CPA免疫抑制小鼠的脾臟指數，即緩解了CPA注射對小鼠脾臟的負面影響。

2.4 AAP-10給藥對免疫抑制小鼠脾淋巴細胞轉化增殖能力的影響分析

表 3 AAP-10給藥對小鼠脾淋巴細胞轉化增殖能力的影響Table 3 Effect of AAP-10 administration on lymphocyte activity of mice

從表3可以看出，與正常對照組相比，CPA模型組小鼠脾淋巴細胞轉化增殖能力極顯著下降（P＜0.01），而AAP-10各劑量組小鼠脾淋巴細胞轉化增殖能力無顯著差異（P＞0.05）。與CPA模型組相比，AAP-10各劑量組小鼠脾淋巴細胞轉化增殖能力均顯著提高（P＜0.05，P＜0.01），說明AAP-10能夠顯著提高免疫抑制小鼠的細胞免疫功能。

2.5 AAP-10給藥對免疫抑制小鼠單核-巨噬細胞功能的影響分析

單核-巨噬細胞屬于機體固有免疫系統重要成員，具有免疫防御、免疫監視、免疫調節以及抗原遞呈等多種免疫功能。小鼠碳廓清實驗可用于評價小鼠單核-巨噬細胞吞噬廓清異體顆粒的能力，從而評價小鼠的非特異性免疫功能。

表 4 AAP-10給藥對小鼠碳廓清能力的影響Table 4 Effect of AAP-10 administration on carbon clearance capacity of mice

從表4可以看出，CPA模型組小鼠碳廓清能力極顯著低于正常對照組（P＜0.01），說明CPA注射導致小鼠單核-巨噬細胞吞噬廓清異體顆粒的能力有所下降。在第31天，AAP-10各劑量組小鼠碳廓清能力與正常對照組相比存在顯著差異（P＜0.05，P＜0.01），但一定劑量的多糖可使吞噬指數增大。與CPA模型組比較，在第17天，AAP-10各劑量組均能極顯著提高CPA免疫抑制小鼠的碳廓清能力（P＜0.01），但在第31天差異不顯著。從實驗結果可以看出，多糖給藥能改善CPA免疫抑制小鼠單核-巨噬細胞的吞噬廓清能力，說明AAP-10具有一定的免疫調節功能。

2.6 AAP-10給藥對免疫抑制小鼠NK細胞活性的影響

表 5 AAP-10給藥對小鼠NK細胞活性的影響Table 5 Effect of AAP-10 administration on NK cell activity of mice

從表5可以看出，與正常對照組相比，CPA模型組小鼠的NK細胞活性雖有所下降，但差異不顯著（P＞0.05）；與CPA模型組相比，AAP-10各劑量組小鼠NK細胞活性在第17天均有顯著提高（P＜0.05，P＜0.01），但在第31天差異不顯著，可能是隨著時間的延長CPA對小鼠的負面影響逐漸減弱所致。

3 討 論

乙醇沉淀是將多糖從其水溶液中分離出來最常用的方法，該方法利用乙醇的脫水作用，降低多糖在水中的溶解度，使多糖沉淀析出。乙醇質量分數不同，沉淀析出的多糖在組成結構和功能方面會有一定的差別[21-23]。本研究利用質量分數10%的乙醇溶液，從產自浙江龍泉地區的一種黑木耳的水提物中分離得到一種組成結構和分子質量分布較均一的多糖AAP-10，得率為8.94%，經精制后純度達到97.58%。

惡性腫瘤是威脅人類健康的重大疾病，近年來其發病率在全球范圍內總體呈上升趨勢。據估計，我國2013年新發惡性腫瘤約368.2萬 例，死亡222.9萬 例，全國惡性腫瘤發病率為270.59/10萬 例，防控形勢非常嚴峻[24]。放化療是目前中晚期惡性腫瘤的主要治療方法，但副作用較大，且對有些惡性腫瘤療效并不理想。黑木耳多糖被報道具有明顯的抗腫瘤活性[25-26]，在我國民間也有在將黑木耳作為腫瘤放化療病人輔食的做法。CPA是一種烷化劑，可干擾DNA及RNA功能，抑制DNA合成，發揮殺傷腫瘤細胞的作用，但對機體正常細胞也有殺傷作用，具有免疫抑制等毒副作用[27-28]。多糖能夠在一定程度上調節機體的免疫功能，拮抗CPA的毒副作用，發揮減毒增效作用[29-30]。脾臟是重要的外周免疫器官，是機體對血源性抗原產生免疫應答的主要場所。本研究結果表明，一定劑量的AAP-10給藥能緩解CPA注射對小鼠脾臟的負面影響。此外，較低劑量（2.5～5.0 mg/（kg·d））的AAP-10給藥就能增強CPA免疫抑制小鼠的脾淋巴細胞轉化增殖能力、單核-巨噬細胞的吞噬廓清能力、NK細胞活性。因此可以認為，黑木耳多糖AAP-10具有增強CPA免疫抑制小鼠免疫功能的作用，且在保健食品、特殊醫學用途食品等領域具有良好的應用前景。