鮮切荸薺表面黃化過程中黃酮類物質和抗氧化活性變化

李長樂，潘永貴*

（海南大學食品學院，海南 海口 570228）

荸薺（Eleocharis tuberosa），別名地栗、馬蹄、烏芋、鳧茈等。荸薺去皮即可食用，且本身也適合進行鮮切加工，但荸薺在經鮮切處理后組織會發生黃化現象[1]，這種現象降低了鮮切荸薺品質，從而研究主要集中在如何控制這些現象的發生，包括采用熱處理法[2-3]、乙醛熏蒸處理[4]、涂膜法[5-6]等。本實驗室研究發現采用體積分數30%乙醇處理同樣可以有效地抑制鮮切荸薺表面黃化的發生[7]，鮮切荸薺黃化物質主要為黃酮類物質，尤其是柚皮素和圣草酚[8-10]。

黃酮類物質作為一種藥用成分，不僅具有治療咽炎、肝炎、咳嗽和高血壓等功效[11]，而且還具有抗氧化[12-13]、抗炎[14-15]、抗菌[16-18]、降糖[19]、抗病毒[20]等作用。因此，本研究以黃化鮮切荸薺表面組織為對象，根據貯藏過程中鮮切荸薺表面色澤及黃酮類物質含量動態變化，結合1,1-苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率、2,2’-聯氨-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽自由基（2,2’-azinobis (3-ehtylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt radical，ABTS+·）清除率、羥自由基清除率、鐵離子還原能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）、總還原能力評價其體外抗氧化活性，并探討三者間相互關系，以期為鮮切荸薺黃化的理論研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮荸薺購于海南海口果蔬批發市場，運回實驗室后經預冷、清洗，挑選大小均一和無機械損傷、無病蟲害的果實進行實驗。

DPPH、ABTS、2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine，TPTZ） 美國Sigma公司；6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox） 上海源葉生物科技公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AR124CN型電子分析天平 奧豪斯儀器有限公司；T6系列紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；CR-10色差儀 日本Konica Minolta公司；TGL-16M高速冷凍離心機 上海盧湘離心機儀器有限公司；SK2210HP型超聲波清洗器 上海科導超聲儀器有限公司；DHG-9023A型電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；SHZ-Ⅲ型循環水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；HWS-260型智能恒溫恒濕箱 浙江托普儀器有限公司；BCD-201WM型低溫冰箱 美的公司。

1.3 方法

1.3.1 原料及預處理

荸薺去皮后縱切成3等份，然后用1 g/L次氯酸鈉溶液殺菌10 min，陰干后，隨機分成2 組。一組用體積分數30%乙醇溶液浸泡10 min，另一組用超純水浸泡10 min。經前期研究發現鮮切荸薺在（8.0±0.5）℃下貯藏不會產生冷害，其品質也能得到較好保持，且適合取樣觀察黃化進度；所以，將兩組樣品陰干后選用保水性較好的保鮮膜結合淺盤包裝方法置于該溫度下貯藏。

1.3.2 樣品提取液制備

分別于第0、3、6、9、12、15天隨機選取不同階段的荸薺組織黃化表層，切取厚度隨個體表層黃化情況而定，一般不超過1 mm。隨后將樣品置于樣品袋中，立即放入-20 ℃下備用。精確稱取鮮切荸薺表面組織10.00 g置于三角瓶中，按1∶30（m/V）料液比加入體積分數60%乙醇溶液，60 ℃下超聲輔助提取15 min，6 000 r/min離心15 min，取上清液，殘渣按以上步驟重復提取1 次，然后合并上清液。真空抽濾后于4 ℃下儲存備用。

1.3.3 色澤的測定

采用色差儀進行測定。每個樣品測定3 個點，每個點測定3 次，每組測定6 個樣品，取平均值。L*值表示亮度，a*值表示紅/綠色，b*值表示黃/藍色，b*值越大說明鮮切荸薺黃色程度越大。

1.3.4 黃酮類物質含量的測定

黃酮類物質含量測定采用硝酸鋁絡合分光光度法[21]。取1.3.2節制備的提取液4.00 mL至10 mL刻度比色管中，加15 mg/mL NaNO2溶液0.3 mL，搖勻后靜置6 min，加入30 mg/mL Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻后靜置6 min，加入4 mL 1.0 mol/L NaOH溶液，用體積分數80%乙醇定容至10 mL，混勻后靜置15 min；搖勻后于510 nm波長處測定吸光度。以蘆丁為標準樣，制作標準曲線，根據標準曲線方程求出提取液中黃酮類物質質量濃度/（mg/mL）。黃酮類物質含量按式（1）進行計算。

式中：ρ為樣品提取液中黃酮質量濃度/（mg/mL）；V0為提取液定容后的體積/mL；V1為提取液測定定容后的體積/mL；V2為提取液測定所用體積/mL；m為樣品質量/g。

1.3.5 抗氧化活性測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除率的測定

DPPH自由基清除率的測定參考Sharmila等[22]的方法略作修改。分別取1.3.2節制備的提取液1.0 mL于試管中，加入0.1 mol/L的DPPH溶液3.0 mL，充分混合后暗處反應30 min，于517 nm波長處測吸光度（Ai）；以體積分數60%乙醇代替DPPH溶液，測吸光度（Aj）；空白組以體積分數60%乙醇代替提取液，測吸光度為Ac。各組均平行測3 次。DPPH自由基清除率的計算見公式（2）。

1.3.5.2 ABTS+·清除率的測定

ABTS+溶液的制備：將25 mL 7 mmol/L ABTS儲備溶液和140 mmol/L 440 μL過硫酸鉀溶液混合，室溫避光反應12～16 h，制備得到ABTS+溶液。ABTS+溶液用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）稀釋，直到其在734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02。

參考鄭飛等[23]的方法略作修改。分別取0.1 mL提取液和3.9 mL ABTS+溶液加入試管中，混勻，室溫下暗處放置6 min，在734 nm波長處測吸光度（Ai）。以體積分數60%乙醇溶液替代提取液同體積的反應混合液為對照，測定吸光度（A0），各組均平行測3 次。ABTS+·清除率的計算見式（3）。

1.3.5.3 羥自由基清除率的測定

羥自由基清除率的測定參考Afify等[24]的方法略作修改。分別吸取2.0 mL提取液于試管中，依次加入2.0 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、2.0 mL 9 mmol/L水楊酸溶液，混合后再加入2.0 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，置于37 ℃下反應30 min，于510 nm波長處測吸光度（Aj），用蒸餾水代替提取液測定吸光度（A0），用蒸餾水代替H2O2溶液測吸光度（Ai），各組均平行測3 次。羥自由基清除率的計算見式（4）。

1.3.5.4 FRAP的測定

FRAP的測定參考Benzie等[25]的方法略作修改。取50 μL提取液，加入1.5 mL FRAP溶液，37 ℃下反應30 min后在593 nm波長處測定吸光度。以Trolox為標品制作標準曲線，標準曲線方程為：y＝1.138 9x+0.008 6（R2＝0.999 1）。提取液還原三價鐵離子能力以達到同樣吸光度所需Trolox的當量（μmol TE/g）表示。各組均平行測3 次。

1.3.5.5 總還原能力測定

參考陳慧等[26]的方法略作修改。分別吸取1.0 mL提取液于試管中，加入0.2 mL pH 6.6的磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L）和1.5 mL體積分數0.3% K3Fe(CN)6溶液，混勻，50 ℃水浴20 min后，迅速冷卻并加入1.0 mL體積分數10%的三氯乙酸溶液，搖勻后以3 000 r/min離心10 min，取上清液2.0 mL，加入0.5 mL體積分數0.3% FeCl3溶液，再加3 mL蒸餾水，充分混勻，在700 nm波長處測定吸光度。以Trolox為標準品制作標準曲線。標準曲線方程為：y＝1.204x+0.129（R2＝0.998），提取液的總還原能力用Trolox標準溶液的當量來表示，單位為μmol TE/g。各組均平行測定3 次。

1.4 數據處理

數據處理采用Excel 2010軟件和SPSS 17.0軟件進行統計分析，用Origin 9.0軟件繪制圖形,實驗數據采用ANOVA進行Duncan’s差異分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 貯藏過程中鮮切荸薺表面色澤變化

表 1 鮮切荸薺表面黃化過程中色澤變化Table 1 Changes in color of fresh-cut Chinese water chestnuts during surface etiolation

如表1所示，隨著貯藏時間延長，鮮切荸薺表面黃化現象加劇，超純水處理組的a*和b*值呈現出先上升后下降的趨勢，二者均在第12天達到最大值，分別是初期的3.8 倍和3.7 倍；12 d后二者出現下降趨勢；而乙醇處理組的a*值和b*值一直呈上升趨勢，到貯藏末期（15 d），與貯藏初期相比b*值僅增加了1.7 倍，表明鮮切荸薺經過乙醇處理后，黃化進程明顯受到抑制。與此相反，兩組鮮切荸薺組織表面亮度L*值均隨著貯藏時間的延長，呈逐漸下降趨勢，但乙醇處理組的組織亮度L*值在整個貯藏期內均高于超純水處理組。

2.2 鮮切荸薺貯藏過程中表面黃酮類物質含量變化

表 2 貯藏過程中鮮切荸薺表面黃酮類物質含量變化Table 2 Change in fl avonoid content in fresh-cut Chinese water chestnut surface during storage mg/g

如表2所示，隨著貯藏時間延長，乙醇處理組的鮮切荸薺表面黃酮類物質含量呈緩慢增長趨勢，到貯藏末期（15 d）時，只有貯藏初期的1.7 倍。而超純水處理組的鮮切荸薺黃酮含量雖在前3 d緩慢增加，但隨后迅速增加，在第12天時達到最大值，為相同貯藏時間乙醇處理組的1.6 倍，隨后黃酮類物質含量輕微下降。整體變化趨勢與鮮切荸薺黃化程度變化相一致。

2.3 貯藏過程中鮮切荸薺表面物質抗氧化活性變化

2.3.1 DPPH自由基、ABTS+·和羥自由基清除率

自由基與鮮切果蔬的抗氧化活性關系緊密，且在一定程度上可反映總抗氧化活性的變化[27]，而DPPH、ABTS+·和羥自由基清除能力測定因操作簡單、靈敏度高成為評價果蔬體外抗氧化活性的主要方法[28-29]。

圖 1 貯藏過程中鮮切荸薺表面物質DPPH自由基（A）、ABTS＋·（B）和羥自由基（C）清除率變化Fig. 1 Change in DPPH (A), ABTS+· (B) and ·OH (C) radical scavenging capacity of fresh-cut Chinese water chestnut surface during storage

如圖1所示，隨著貯藏時間延長，乙醇處理組的鮮切荸薺表面提取物DPPH自由基、ABTS+·和羥自由基3 種自由基清除率僅有小幅度提高，在貯藏末期（15 d）分別為貯藏初期的3.0、4.7 倍和1.2 倍；而超純水處理組對各自由基的清除率在前3 d 略微上升，隨后快速增加，在貯藏末期趨緩并達到最大值，此時分別是最初貯藏時的6.9、22.2 倍和3.0 倍，是同期乙醇處理組的2.4、4.7 倍和2.6 倍。表明隨著貯藏時間的延長，黃化程度的加深，鮮切荸薺表面對DPPH自由基、ABTS+·和羥自由基清除率均得到顯著提高。

2.3.2 FARP和總還原能力變化

圖 2 貯藏過程中鮮切荸薺表面物質FRAP（A）和總還原能力（B）的變化Fig. 2 Change in ferric reducing antioxidant power (A) and total reducing power (B) of fresh-cut Chinese water chestnut surface during storage

從圖2可以看出，兩組組織中，FRAP和總還原能力均隨著貯藏時間的延長而增強。經乙醇處理黃化受到抑制后，鮮切荸薺在整個貯藏期內FRAP和總還原能力僅分別提高1.0 倍和1.1 倍；而經超純水處理的鮮切荸薺隨著黃化的發生，其FRAP和總還原能力雖然在前6 d均增長緩慢，但隨后迅速增加，到12 d后趨于穩定，12 d時較貯藏初期分別提高了7.14 倍和17.3 倍。且FRAP和總還原能力達到最大值時，超純水處理組的鮮切荸薺分別是乙醇處理組的4.4 倍和8.8 倍。以上表明黃化程度越強，FRAP和總還原能力越高。

2.4 黃化過程中色澤、黃酮類物質含量與抗氧化活性相關性分析

表 3 鮮切荸薺黃化過程中色澤、黃酮類物質含量與體外抗氧化活性相關性Table 3 Correlations between fl avonoid content, antioxidant activity and b* value of fresh-cut Chinese water chestnuts during storage

如表3所示，反映黃化程度的b*值與黃酮類物質含量呈極顯著正相關（r＝0.946）；同樣，b*值和DPPH自由基、ABTS+·、羥自由基清除率及總還原能力同樣呈極顯著相關，相關系數分別為0.895、0.964、0.911和0.886；與FRAP顯著性相關（r＝0.939）；表明鮮切荸薺組織黃化程度的加深，與黃酮類物質含量和抗氧化能力密切相關。進一步對鮮切荸薺中黃酮類物質含量與DPPH自由基、ABTS+·清除率、FRAP和總還原能力相關性統計分析表明，它們之間同樣達到極顯著水平，相關系數分別為0.875、0.881、0.941和0.897；而與羥自由基清除率相關系數僅為0.641。該結果表明，超純水處理組的鮮切荸薺隨著黃化程度的加深，其抗氧化能力增強，這是黃酮類物質含量增加的直接結果。

3 討 論

前期通過對鮮切荸薺表面組織中代謝產物及酶促褐變相關酶的動態研究表明，鮮切荸薺在貯藏過程中的黃化現象有別于酶促褐變[1,30]，并且主要是由次生代謝途徑生成的黃酮類物質引起的[32]。本研究進一步證明，經超純水處理的鮮切荸薺表面b*值在貯藏前12 d，隨著貯藏時間延長，上升速率明顯加快，黃化進程明顯加劇，并在貯藏末期隨著褐變發生，有所下降。而經乙醇處理的鮮切荸薺黃化明顯變緩，并且未出現褐變。與此相對應，隨著黃化程度加深，經超純水處理的鮮切荸薺組織表面黃酮類物質含量迅速上升，而隨著貯藏末期鮮切荸薺組織表面出現褐變，黃酮類物質呈輕微下降趨勢。鮮切荸薺黃化物質主要成分為柚皮素、圣草酚等黃酮類物質[8-9]，本研究進一步證明了鮮切荸薺組織表面黃化程度的加深與柚皮素、圣草酚等黃酮類含量呈正相關。許多研究已經表明黃酮類物質具有明顯抗氧化作用。目前認為，生物體中至少存在4 種抗氧化系統，即抗氧化酶系統、蛋白等大分子、多酚等小分子和激素，它們各自都有不同的化學和物理特征；因此，評定生物體抗氧化活性需要將3 種以上且抗氧化機理不同的方法結合起來，同時對選用方法進行優化，以此來提高測定結果的客觀性[31]。本研究表明，隨著黃酮類物質生成增加，鮮切荸薺的DPPH自由基、ABTS+·、羥自由基清除率、FRAP和總還原能力顯著提高，而統計分析也表明鮮切荸薺表面黃化程度與黃酮類物質含量及抗氧化能力之間呈顯著正相關性。

總之，鮮切荸薺組織中黃酮類物質含量與組織黃化密切相關，并且隨著鮮切荸薺組織黃化的發生，組織抗氧化能力明顯提高。因此，開發和生產荸薺黃化后黃酮類相關產品，進一步開發荸薺的功能食品和藥品成為可能。當然，是否其中也存在一些不安全因素，需要進一步研究。