鮮切荸薺表面黃化過(guò)程中黃酮類物質(zhì)和抗氧化活性變化

李長(zhǎng)樂(lè)，潘永貴*

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南 海口 570228）

荸薺（Eleocharis tuberosa），別名地栗、馬蹄、烏芋、鳧茈等。荸薺去皮即可食用，且本身也適合進(jìn)行鮮切加工，但荸薺在經(jīng)鮮切處理后組織會(huì)發(fā)生黃化現(xiàn)象[1]，這種現(xiàn)象降低了鮮切荸薺品質(zhì)，從而研究主要集中在如何控制這些現(xiàn)象的發(fā)生，包括采用熱處理法[2-3]、乙醛熏蒸處理[4]、涂膜法[5-6]等。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)采用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇處理同樣可以有效地抑制鮮切荸薺表面黃化的發(fā)生[7]，鮮切荸薺黃化物質(zhì)主要為黃酮類物質(zhì)，尤其是柚皮素和圣草酚[8-10]。

黃酮類物質(zhì)作為一種藥用成分，不僅具有治療咽炎、肝炎、咳嗽和高血壓等功效[11]，而且還具有抗氧化[12-13]、抗炎[14-15]、抗菌[16-18]、降糖[19]、抗病毒[20]等作用。因此，本研究以黃化鮮切荸薺表面組織為對(duì)象，根據(jù)貯藏過(guò)程中鮮切荸薺表面色澤及黃酮類物質(zhì)含量動(dòng)態(tài)變化，結(jié)合1,1-苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率、2,2’-聯(lián)氨-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽自由基（2,2’-azinobis (3-ehtylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt radical，ABTS+·）清除率、羥自由基清除率、鐵離子還原能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）、總還原能力評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性，并探討三者間相互關(guān)系，以期為鮮切荸薺黃化的理論研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮荸薺購(gòu)于海南海口果蔬批發(fā)市場(chǎng)，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后經(jīng)預(yù)冷、清洗，挑選大小均一和無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)病蟲(chóng)害的果實(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

DPPH、ABTS、2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine，TPTZ） 美國(guó)Sigma公司；6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox） 上海源葉生物科技公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AR124CN型電子分析天平 奧豪斯儀器有限公司；T6系列紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；CR-10色差儀 日本Konica Minolta公司；TGL-16M高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘離心機(jī)儀器有限公司；SK2210HP型超聲波清洗器 上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；DHG-9023A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；HWS-260型智能恒溫恒濕箱 浙江托普儀器有限公司；BCD-201WM型低溫冰箱 美的公司。

1.3 方法

1.3.1 原料及預(yù)處理

荸薺去皮后縱切成3等份，然后用1 g/L次氯酸鈉溶液殺菌10 min，陰干后，隨機(jī)分成2 組。一組用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液浸泡10 min，另一組用超純水浸泡10 min。經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)鮮切荸薺在（8.0±0.5）℃下貯藏不會(huì)產(chǎn)生冷害，其品質(zhì)也能得到較好保持，且適合取樣觀察黃化進(jìn)度；所以，將兩組樣品陰干后選用保水性較好的保鮮膜結(jié)合淺盤(pán)包裝方法置于該溫度下貯藏。

1.3.2 樣品提取液制備

分別于第0、3、6、9、12、15天隨機(jī)選取不同階段的荸薺組織黃化表層，切取厚度隨個(gè)體表層黃化情況而定，一般不超過(guò)1 mm。隨后將樣品置于樣品袋中，立即放入-20 ℃下備用。精確稱取鮮切荸薺表面組織10.00 g置于三角瓶中，按1∶30（m/V）料液比加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液，60 ℃下超聲輔助提取15 min，6 000 r/min離心15 min，取上清液，殘?jiān)匆陨喜襟E重復(fù)提取1 次，然后合并上清液。真空抽濾后于4 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 色澤的測(cè)定

采用色差儀進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)樣品測(cè)定3 個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)測(cè)定3 次，每組測(cè)定6 個(gè)樣品，取平均值。L*值表示亮度，a*值表示紅/綠色，b*值表示黃/藍(lán)色，b*值越大說(shuō)明鮮切荸薺黃色程度越大。

1.3.4 黃酮類物質(zhì)含量的測(cè)定

黃酮類物質(zhì)含量測(cè)定采用硝酸鋁絡(luò)合分光光度法[21]。取1.3.2節(jié)制備的提取液4.00 mL至10 mL刻度比色管中，加15 mg/mL NaNO2溶液0.3 mL，搖勻后靜置6 min，加入30 mg/mL Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻后靜置6 min，加入4 mL 1.0 mol/L NaOH溶液，用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇定容至10 mL，混勻后靜置15 min；搖勻后于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)樣，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出提取液中黃酮類物質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）。黃酮類物質(zhì)含量按式（1）進(jìn)行計(jì)算。

式中：ρ為樣品提取液中黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V0為提取液定容后的體積/mL；V1為提取液測(cè)定定容后的體積/mL；V2為提取液測(cè)定所用體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.5 抗氧化活性測(cè)定

1.3.5.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

DPPH自由基清除率的測(cè)定參考Sharmila等[22]的方法略作修改。分別取1.3.2節(jié)制備的提取液1.0 mL于試管中，加入0.1 mol/L的DPPH溶液3.0 mL，充分混合后暗處反應(yīng)30 min，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度（Ai）；以體積分?jǐn)?shù)60%乙醇代替DPPH溶液，測(cè)吸光度（Aj）；空白組以體積分?jǐn)?shù)60%乙醇代替提取液，測(cè)吸光度為Ac。各組均平行測(cè)3 次。DPPH自由基清除率的計(jì)算見(jiàn)公式（2）。

1.3.5.2 ABTS+·清除率的測(cè)定

ABTS+溶液的制備：將25 mL 7 mmol/L ABTS儲(chǔ)備溶液和140 mmol/L 440 μL過(guò)硫酸鉀溶液混合，室溫避光反應(yīng)12～16 h，制備得到ABTS+溶液。ABTS+溶液用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）稀釋，直到其在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度為0.70±0.02。

參考鄭飛等[23]的方法略作修改。分別取0.1 mL提取液和3.9 mL ABTS+溶液加入試管中，混勻，室溫下暗處放置6 min，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度（Ai）。以體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液替代提取液同體積的反應(yīng)混合液為對(duì)照，測(cè)定吸光度（A0），各組均平行測(cè)3 次。ABTS+·清除率的計(jì)算見(jiàn)式（3）。

1.3.5.3 羥自由基清除率的測(cè)定

羥自由基清除率的測(cè)定參考Afify等[24]的方法略作修改。分別吸取2.0 mL提取液于試管中，依次加入2.0 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、2.0 mL 9 mmol/L水楊酸溶液，混合后再加入2.0 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，置于37 ℃下反應(yīng)30 min，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度（Aj），用蒸餾水代替提取液測(cè)定吸光度（A0），用蒸餾水代替H2O2溶液測(cè)吸光度（Ai），各組均平行測(cè)3 次。羥自由基清除率的計(jì)算見(jiàn)式（4）。

1.3.5.4 FRAP的測(cè)定

FRAP的測(cè)定參考Benzie等[25]的方法略作修改。取50 μL提取液，加入1.5 mL FRAP溶液，37 ℃下反應(yīng)30 min后在593 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以Trolox為標(biāo)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝1.138 9x+0.008 6（R2＝0.999 1）。提取液還原三價(jià)鐵離子能力以達(dá)到同樣吸光度所需Trolox的當(dāng)量（μmol TE/g）表示。各組均平行測(cè)3 次。

1.3.5.5 總還原能力測(cè)定

參考陳慧等[26]的方法略作修改。分別吸取1.0 mL提取液于試管中，加入0.2 mL pH 6.6的磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L）和1.5 mL體積分?jǐn)?shù)0.3% K3Fe(CN)6溶液，混勻，50 ℃水浴20 min后，迅速冷卻并加入1.0 mL體積分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸溶液，搖勻后以3 000 r/min離心10 min，取上清液2.0 mL，加入0.5 mL體積分?jǐn)?shù)0.3% FeCl3溶液，再加3 mL蒸餾水，充分混勻，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝1.204x+0.129（R2＝0.998），提取液的總還原能力用Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液的當(dāng)量來(lái)表示，單位為μmol TE/g。各組均平行測(cè)定3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010軟件和SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Origin 9.0軟件繪制圖形,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用ANOVA進(jìn)行Duncan’s差異分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏過(guò)程中鮮切荸薺表面色澤變化

表 1 鮮切荸薺表面黃化過(guò)程中色澤變化Table 1 Changes in color of fresh-cut Chinese water chestnuts during surface etiolation

如表1所示，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，鮮切荸薺表面黃化現(xiàn)象加劇，超純水處理組的a*和b*值呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，二者均在第12天達(dá)到最大值，分別是初期的3.8 倍和3.7 倍；12 d后二者出現(xiàn)下降趨勢(shì)；而乙醇處理組的a*值和b*值一直呈上升趨勢(shì)，到貯藏末期（15 d），與貯藏初期相比b*值僅增加了1.7 倍，表明鮮切荸薺經(jīng)過(guò)乙醇處理后，黃化進(jìn)程明顯受到抑制。與此相反，兩組鮮切荸薺組織表面亮度L*值均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，呈逐漸下降趨勢(shì)，但乙醇處理組的組織亮度L*值在整個(gè)貯藏期內(nèi)均高于超純水處理組。

2.2 鮮切荸薺貯藏過(guò)程中表面黃酮類物質(zhì)含量變化

表 2 貯藏過(guò)程中鮮切荸薺表面黃酮類物質(zhì)含量變化Table 2 Change in fl avonoid content in fresh-cut Chinese water chestnut surface during storage mg/g

如表2所示，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，乙醇處理組的鮮切荸薺表面黃酮類物質(zhì)含量呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)，到貯藏末期（15 d）時(shí)，只有貯藏初期的1.7 倍。而超純水處理組的鮮切荸薺黃酮含量雖在前3 d緩慢增加，但隨后迅速增加，在第12天時(shí)達(dá)到最大值，為相同貯藏時(shí)間乙醇處理組的1.6 倍，隨后黃酮類物質(zhì)含量輕微下降。整體變化趨勢(shì)與鮮切荸薺黃化程度變化相一致。

2.3 貯藏過(guò)程中鮮切荸薺表面物質(zhì)抗氧化活性變化

2.3.1 DPPH自由基、ABTS+·和羥自由基清除率

自由基與鮮切果蔬的抗氧化活性關(guān)系緊密，且在一定程度上可反映總抗氧化活性的變化[27]，而DPPH、ABTS+·和羥自由基清除能力測(cè)定因操作簡(jiǎn)單、靈敏度高成為評(píng)價(jià)果蔬體外抗氧化活性的主要方法[28-29]。

圖 1 貯藏過(guò)程中鮮切荸薺表面物質(zhì)DPPH自由基（A）、ABTS＋·（B）和羥自由基（C）清除率變化Fig. 1 Change in DPPH (A), ABTS+· (B) and ·OH (C) radical scavenging capacity of fresh-cut Chinese water chestnut surface during storage

如圖1所示，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，乙醇處理組的鮮切荸薺表面提取物DPPH自由基、ABTS+·和羥自由基3 種自由基清除率僅有小幅度提高，在貯藏末期（15 d）分別為貯藏初期的3.0、4.7 倍和1.2 倍；而超純水處理組對(duì)各自由基的清除率在前3 d 略微上升，隨后快速增加，在貯藏末期趨緩并達(dá)到最大值，此時(shí)分別是最初貯藏時(shí)的6.9、22.2 倍和3.0 倍，是同期乙醇處理組的2.4、4.7 倍和2.6 倍。表明隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，黃化程度的加深，鮮切荸薺表面對(duì)DPPH自由基、ABTS+·和羥自由基清除率均得到顯著提高。

2.3.2 FARP和總還原能力變化

圖 2 貯藏過(guò)程中鮮切荸薺表面物質(zhì)FRAP（A）和總還原能力（B）的變化Fig. 2 Change in ferric reducing antioxidant power (A) and total reducing power (B) of fresh-cut Chinese water chestnut surface during storage

從圖2可以看出，兩組組織中，F(xiàn)RAP和總還原能力均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。經(jīng)乙醇處理黃化受到抑制后，鮮切荸薺在整個(gè)貯藏期內(nèi)FRAP和總還原能力僅分別提高1.0 倍和1.1 倍；而經(jīng)超純水處理的鮮切荸薺隨著黃化的發(fā)生，其FRAP和總還原能力雖然在前6 d均增長(zhǎng)緩慢，但隨后迅速增加，到12 d后趨于穩(wěn)定，12 d時(shí)較貯藏初期分別提高了7.14 倍和17.3 倍。且FRAP和總還原能力達(dá)到最大值時(shí)，超純水處理組的鮮切荸薺分別是乙醇處理組的4.4 倍和8.8 倍。以上表明黃化程度越強(qiáng)，F(xiàn)RAP和總還原能力越高。

2.4 黃化過(guò)程中色澤、黃酮類物質(zhì)含量與抗氧化活性相關(guān)性分析

表 3 鮮切荸薺黃化過(guò)程中色澤、黃酮類物質(zhì)含量與體外抗氧化活性相關(guān)性Table 3 Correlations between fl avonoid content, antioxidant activity and b* value of fresh-cut Chinese water chestnuts during storage

如表3所示，反映黃化程度的b*值與黃酮類物質(zhì)含量呈極顯著正相關(guān)（r＝0.946）；同樣，b*值和DPPH自由基、ABTS+·、羥自由基清除率及總還原能力同樣呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.895、0.964、0.911和0.886；與FRAP顯著性相關(guān)（r＝0.939）；表明鮮切荸薺組織黃化程度的加深，與黃酮類物質(zhì)含量和抗氧化能力密切相關(guān)。進(jìn)一步對(duì)鮮切荸薺中黃酮類物質(zhì)含量與DPPH自由基、ABTS+·清除率、FRAP和總還原能力相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析表明，它們之間同樣達(dá)到極顯著水平，相關(guān)系數(shù)分別為0.875、0.881、0.941和0.897；而與羥自由基清除率相關(guān)系數(shù)僅為0.641。該結(jié)果表明，超純水處理組的鮮切荸薺隨著黃化程度的加深，其抗氧化能力增強(qiáng)，這是黃酮類物質(zhì)含量增加的直接結(jié)果。

3 討 論

前期通過(guò)對(duì)鮮切荸薺表面組織中代謝產(chǎn)物及酶促褐變相關(guān)酶的動(dòng)態(tài)研究表明，鮮切荸薺在貯藏過(guò)程中的黃化現(xiàn)象有別于酶促褐變[1,30]，并且主要是由次生代謝途徑生成的黃酮類物質(zhì)引起的[32]。本研究進(jìn)一步證明，經(jīng)超純水處理的鮮切荸薺表面b*值在貯藏前12 d，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，上升速率明顯加快，黃化進(jìn)程明顯加劇，并在貯藏末期隨著褐變發(fā)生，有所下降。而經(jīng)乙醇處理的鮮切荸薺黃化明顯變緩，并且未出現(xiàn)褐變。與此相對(duì)應(yīng)，隨著黃化程度加深，經(jīng)超純水處理的鮮切荸薺組織表面黃酮類物質(zhì)含量迅速上升，而隨著貯藏末期鮮切荸薺組織表面出現(xiàn)褐變，黃酮類物質(zhì)呈輕微下降趨勢(shì)。鮮切荸薺黃化物質(zhì)主要成分為柚皮素、圣草酚等黃酮類物質(zhì)[8-9]，本研究進(jìn)一步證明了鮮切荸薺組織表面黃化程度的加深與柚皮素、圣草酚等黃酮類含量呈正相關(guān)。許多研究已經(jīng)表明黃酮類物質(zhì)具有明顯抗氧化作用。目前認(rèn)為，生物體中至少存在4 種抗氧化系統(tǒng)，即抗氧化酶系統(tǒng)、蛋白等大分子、多酚等小分子和激素，它們各自都有不同的化學(xué)和物理特征；因此，評(píng)定生物體抗氧化活性需要將3 種以上且抗氧化機(jī)理不同的方法結(jié)合起來(lái)，同時(shí)對(duì)選用方法進(jìn)行優(yōu)化，以此來(lái)提高測(cè)定結(jié)果的客觀性[31]。本研究表明，隨著黃酮類物質(zhì)生成增加，鮮切荸薺的DPPH自由基、ABTS+·、羥自由基清除率、FRAP和總還原能力顯著提高，而統(tǒng)計(jì)分析也表明鮮切荸薺表面黃化程度與黃酮類物質(zhì)含量及抗氧化能力之間呈顯著正相關(guān)性。

總之，鮮切荸薺組織中黃酮類物質(zhì)含量與組織黃化密切相關(guān)，并且隨著鮮切荸薺組織黃化的發(fā)生，組織抗氧化能力明顯提高。因此，開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)荸薺黃化后黃酮類相關(guān)產(chǎn)品，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)荸薺的功能食品和藥品成為可能。當(dāng)然，是否其中也存在一些不安全因素，需要進(jìn)一步研究。