CD40對晚期上皮性卵巢癌新輔助化療敏感性的預測價值

陳曉晴　劉玉玲

[摘要]目的 通過檢測卵巢癌組織中的CD40表達水平，判斷新輔助化療（NACT）對卵巢癌中CD40分子表達的影響，從而進一步推斷CD40分子是否可以作為預測卵巢癌化療敏感性的生物學標志。方法 選取2015年12月～2017年12月在我院就診的晚期上皮性卵巢癌患者80例，根據術前有無進行NACT，分為行NACT者30例，為A組，未行NACT者50例，為B組，對應的卵巢癌組織術后病理石蠟切塊分別為30枚和50枚。采用免疫組織化學方法檢測兩組卵巢癌組織中的CD40分子表達水平。結果 A組的化療總有效率（80.00%）明顯高于B組（58.00%），差異有統計學意義（P<0.05）。A組的CD40陽性表達率（56.67%）低于B組（80.00%），差異有統計學意義（P<0.05）；A組中化療有效者CD40的陽性表達率（45.83%）明顯低于化療無效者（100.00%），差異有統計學意義（P<0.05）。CD40在晚期卵巢癌中的表達與Ki-67成正相關（r=0.539，P=0.000）。結論 CD40在晚期卵巢癌NACT者和未行NACT中的表達差異顯著。CD40可以作為預測新輔助化療敏感性的生物學標志物，有助于指導NACT在晚期卵巢癌中的應用。

[關鍵詞]卵巢癌；新輔助化療；CD40；Ki-67；免疫組織化學

[中圖分類號] R737.31 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）6（c）-0017-04

[Abstract]Objective To determine the influence of neoadjuvant chemotherapy （NACT） on the expression of CD40 in ovarian cancer，and further infer whether the CD40 molecule can be used as a biological marker to predict the chemosensitivity of ovarian cancer by examining the expression of CD40 in ovarian cancer tissue.Methods Eighty patients with advanced epithelial ovarian cancer treated in our hospital from December 2015 to December 2017 were selected and they were classified into group A （n=30） given NACT and group B （n=50） without NACT according to whether they performed neoadjuvant chemotherapy before surgery or not.The corresponding paraffin sections of ovarian cancer tissues were 30 and 50 respectively.Immunohistochemical method was used to detect the expression of CD40 in two groups of ovarian cancer tissue.Results The total effective rate of chemotherapy in group A （80.00%） was significantly higher than that of group B （58.00%），and the difference was statistically significant （P<0.05）.The positive expression rate of CD40 in group A （56.67%） was lower than that of group B （80.00%），and the difference was statistically significant （P<0.05）.The positive expression rate of CD40 in chemo effective patients （45.83%） was significantly lower than that in chemo ineffective patients （100.00%） of group A，and the difference was statistically significant （P<0.05）.The expression of CD40 in advanced ovarian cancer was positively correlated with Ki-67 （r=0.539，P=0.000）.Conclusion The expression of CD40 was significantly different between NACT and NACT of advanced ovarian cancer.CD40 can be used as a biomarker for predicting the sensitivity of NACT，and it helps to guide the application of NACT in advanced ovarian cancer.

[Key words]Ovarian cancer；Neoadjuvant chemotherapy；CD40；Ki-67；Immunohistochemistry

卵巢癌是女性生殖道最常見的三大惡性腫瘤之一，其病死率在婦科腫瘤中居首位[1]?，F階段卵巢癌主要采用手術+鉑類化療方案，對于不能直接進行手術治療的患者，采用新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NACT）。但是目前NACT的應用缺乏更加規范化、個體化的治療標準，且導致卵巢癌生物學行為的分子機制尚不明確。

CD40是具有48-50KD的Ⅰ型跨膜糖蛋白[2-3]。研究表明CD40除了廣泛表達于B細胞、上皮細胞、內皮細胞等外，在浸潤性乳腺導管癌、宮頸癌及彌漫大B細胞淋巴瘤等腫瘤組織中也呈高表達。

目前對于CD40在卵巢癌中表達的研究較少，尤其是CD40對NACT的敏感性，故本課題現對行NACT者及未行NACT者，通過免疫組織化學方法檢測兩組行NACT后和未行NACT卵巢癌組織中的CD40表達水平，通過Ki-67來量化CD40與晚期卵巢癌NACT敏感性的關系，判斷NACT對卵巢癌中CD40分子表達的影響，從而進一步推斷CD40分子是否可以作為預測卵巢癌化療敏感性的生物學標志。

1資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年12月～2017年12月在我院就診的80例晚期卵巢癌患者，其中行NACT聯合間歇性腫瘤細胞減滅術者30例，為A組，年齡為44～73歲，平均53歲；未行NACT而行初始腫瘤細胞減滅術者50例，為B組，年齡為41～69歲，平均50歲。實驗對象：采用免疫組織化學方法檢測NACT者晚期卵巢癌術后病理石蠟塊標本30枚、行初始腫瘤細胞減滅術晚期卵巢癌病理石蠟塊標本50枚。

1.2 納入標準、排除標準

納入標準：①所有患者入院前未進行任何治療；②A組術前影像學檢查顯示大量腹腔積液、盆腔包塊、腹膜轉移；③A組術前血清CA125>1000 U/ml；④A組術前均行1～3個周期的化療；⑤A組術前均通過影像學檢查、超聲引導下穿刺引流，并且術后確診為晚期上皮性卵巢癌者；⑥所有研究對象臨床資料完整，且簽署知情同意書。所有行NACT的患者均按照最新《NCCN指南》中的標準NACT紫杉醇+鉑類（TP）方案進行。所有入組患者均行理想的腫瘤細胞減滅術。實驗中涉及的受試者權益和倫理學均符合有關規定。排除標準：①無術后明確病理診斷者；②合并其他惡性腫瘤者；③術前評估不能耐受該手術者。

1.3 療效評價標準

完全緩解（CR）：所有病灶消失，且CA125≤35 U/ml；部分緩解（PR）：靶病灶最大直徑之和減少>30%，CA125>35 U/ml或者CA125下降最初高值的50%；疾病穩定（SD）：靶病灶最大直徑之和減少30%或者增加病灶未達病情進展（PD），或CA125值未見明顯增高；PD：靶病灶最大直徑之和增加>20%，出現新的病灶，或者CA125值升高至正常水平的2倍以上?；熅徑?部分緩解+完全緩解。

1.4 實驗主要試劑和方法

鼠抗人CD40單克隆抗體（H-10）：13128購自圣克魯斯生物技術有限公司；鼠抗人Ki-67單克隆抗體購自基因科技（上海）有限公司。采用免疫組織化學SP染色法。實驗步驟：①將石蠟標本進行連續切片，在78℃烤箱進行烤片1 h；②脫蠟：二甲苯中進行脫蠟5～10 min，用PBS（pH=7.4）反復沖洗；③抗原修復：在盛有檸檬酸鹽修復液（pH=6.0）的高壓鍋中，進行抗原修復，PBS沖洗3 min×3次；④阻斷內源性過氧化物酶，PBS沖洗3 min×3次；⑤將1滴（約50 μl）第一抗體滴加在每張切片中，CD40和Ki-67抗體的工作濃度為1∶100，放入4℃冰箱中過夜；⑥加入反應增強液，室溫下孵育20 min；⑦將1滴（50 μl）二抗即酶標抗鼠聚合物滴加在每張切片中，在室溫下孵育50 min后去除PBS液；⑧滴加DAB顯色劑進行顯色，顯微鏡下觀察染色效果；⑨終止顯色，進行復染、分化，自來水反復沖洗，PBS沖洗；⑩用梯度乙醇進行脫水干燥，使用二甲苯透明及中性樹膠封片。操作步驟嚴格按照SP試劑盒說明書進行，以提供的陽性對照片作為陽性對照，陰性對照片除用PBS代替一抗外，其余步驟相同。

1.5結果判定

所有的CD40和Ki-67的切片均由病理科兩位高年資醫生對結果進行判定。CD40染色陽性為棕黃色，主要存在于細胞膜上，胞質著色亦為陽性。Ki-67主要定位于細胞核，胞質、胞核同時呈棕黃色亦為陽性。每張切片隨機觀察10個高倍視野（10×40），每個視野取100個細胞，記分標準參照免疫反應計分法（immuno reactive score，IRS） 基于3個參數的半定量記數方法：染色強度評分以無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞所占比例評分以陽性細胞數≤25%為0分，25%～50% 為1分，50%～75% 為2分，>75%為3分；每例最后得分為A項×B項：0分為陰性，1分為弱陽性（+），2～3 分為陽性（++），>3分為強陽性（+++） 。

1.6 統計學方法

數據采用SPSS 21.0軟件進行分析，計數資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 晚期卵巢癌不同化療時機的臨床療效的比較

A組化療總有效率為 80.00%，B組為58.00%，兩組比較，差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。

2.2 A、B組中CD40陽性表達率的比較

A組的CD40陽性表達率為56.67%，B組為80.00%，兩組比較，差異有統計學意義（P<0.05）（表2）。

2.3 NACT者中不同臨床療效組CD40陽性表達率的比較

A組中化療有效組CD40的陽性表達率為45.83%，無效組陽性率為100.00%，兩組比較，差異有統計學意義（P<0.05）（表3）。

2.4 CD40與Ki-67在晚期卵巢癌中表達的相關性

CD40 與 Ki-67在晚期卵巢癌中的表達成正相關（r=0.539，P=0.000）（表4）。

3 討論

腫瘤的發生、發展是一個多基因的復雜過程。卵巢癌的發生機制尚不明確，且生存率較低尤其是晚期卵巢癌患者。對于巨塊型的卵巢癌患者或者直接失去手術時機的晚期卵巢癌患者，因為其淋巴結轉移及脈管侵犯早，或者遠處轉移風險較高，單純手術治療不能取得滿意的治療效果。近年來，有學者提出在術前應用NACT，應用于晚期卵巢癌。雖然目前的研究結果顯示NACT可以提高卵巢癌患者的生存質量，減少腫瘤復發[4]，并且有文獻指出NACT聯合中間性腫瘤細胞減滅術對晚期卵巢癌的治療有效[5-7]，但是尋找預測NACT敏感性的指標尤為重要。

CD40位于20號染色體上，是由8個內含子和9個外顯子組成的長臂[8]。CD40可以在B細胞、單核巨噬細胞等細胞中表達，但是正常組織中檢測含量較少。有研究表明，CD40分子可以促進惡性腫瘤細胞的增殖作用[9]。CD40的配體為CD40L，是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白。CD40和CD40L的特異性結合是CD40介導的信號轉導的重要步驟。CD40介導的信號轉導可以誘導T、B細胞活化，產生細胞因子，參與自身免疫性疾病的發病過程[10-11]。隨著越來越多的研究證明，CD40分子與上皮性腫瘤的分化、浸潤轉移有關，與腫瘤血管形成也有關[12]。CD40與單核細胞表面受體結合從而誘導基質釋放金屬蛋白酶，從而使腫瘤細胞轉移侵襲[13]。另有研究表明，CD40分子可以促進惡性腫瘤細胞的增殖作用[14]。主要是因為惡性腫瘤細胞表達少或者不表達免疫原性細胞克隆產物，所以可以逃離免疫細胞的識別和監視。CD40分子是免疫細胞與腫瘤細胞的“中介”，通過產生一系列的反應，在這兩種細胞間傳遞信息，發揮作用。CD40成為現在研究腫瘤發生機制及腫瘤治療中的研究熱點。

本研究結果顯示，晚期卵巢癌NACT者CD40陽性表達率低于未行NACT者（P<0.05）。本研究只是研究晚期卵巢癌，對CD40的陽性表達是否與腫瘤分期未作研究，但是在黃沁等[15]的研究中指出臨床分期與CD40分子的表達無明顯相關性（P>0.05）。黃建安等[16]的研究指出，CD40分子的表達與臨床分期、淋巴結轉移明顯相關（P<0.05）。故CD40分子的表達與臨床分期的關系還不明確，需要更多的研究來證實。但是根據本研究結果NACT可以降低CD40在晚期卵巢癌中的表達，提示CD40對NACT有敏感性。

本研究中在NACT有效組中CD40的陽性表達率低于無效組（P<0.05），提示在NACT組有效者中CD40表達下降。結合本研究中NACT者中CD40分子陽性率低于未行NACT者CD40分子陽性率，推測可能是因為化療藥物主要是作用于增殖中的細胞使得細胞周期停滯，從而使細胞凋亡，而CD40與CD40L連接使細胞周期阻滯在G2/M期，化療藥物的作用和CD40與CD40L的作用類似，有可能是化療藥物與CD40信號產生的“協同作用”，從而產生更好的治療效果。這與Yahara等[17]研究的CD40與CD40L結合可以提高腫瘤細胞對輔助化療的敏感性的結論相似，提示CD40分子可以作為預測NACT敏感性的腫瘤標志物，并且CD40與CD40L的結合可以抑制腫瘤細胞的生長和引導細胞周期的停滯，并在一定程度上可誘導敏感細胞的凋亡，從而成為腫瘤治療研究新的熱點。

Ki-67核抗原是存在于增殖細胞中的相關性抗原。它在增生活躍的細胞中普遍表達，但是在“靜止”細胞中表達不明顯或者不表達，并且在細胞的周期的各個階段都有表達，除外有絲分裂G0期，正是因為這種特別的生物學特征使Ki-67成為可以反映腫瘤細胞增殖活性的非常可靠的生物標志物。Ki-67在腫瘤組織中的表達含量越高，表明腫瘤細胞的增殖活性越高?；熕幬镆舱亲饔糜谶@種增殖活躍的癌細胞，其具有最強的致死性并且能夠快速的誘導細胞凋亡，表明Ki-67與腫瘤對化療的敏感性有關。Ki-67能更好地反映增殖活躍的細胞的數量，過度的表達常促使細胞增生，對惡性和良性腫瘤的鑒別有一定意義[18]。

Ki-67已經應用于多種惡性腫瘤細胞的鑒別中，如有研究指出在口腔鱗狀細胞癌中術前應用NACT后Ki-67陽性率下降，認為可以抑制腫瘤細胞的增殖。Qin等[19]、Wu等[20]也分別分析了乳腺癌、胃癌患者NACT后Ki-67陽性率明顯下降，證實了Ki-67與預測NACT的敏感性有關。

本研究中CD40與Ki-67共表達的分析表明兩者表達成正相關（r=0.539，P=0.000）。CD40與Ki-67的表達存在一定的“協同作用”，提示Ki-67高表達者，化療有效率高，對化療敏感；同時CD40也存在高表達者，化療有效，這也是從另一方面證實CD40可以預測晚期卵巢癌NACT敏感性。在臨床中Ki-67已經被用來檢測卵巢癌的惡性程度，根據Ki-67與CD40的“協同作用”，聯合檢測晚期卵巢癌患者中CD40和Ki-67的表達情況，對于預測晚期卵巢癌NACT的敏感性及檢測卵巢癌的惡性程度具有重要的臨床意義。

綜上所述，CD40和Ki-67分子在卵巢癌的中的異常表達對卵巢癌的發生、發展有重要意義，并且兩者存在協同作用，兩者在預測卵巢癌NACT的敏感性有重要意義，但是對于CD40在卵巢癌中的作用機制需要更進一步的研究，也許不久的將來CD40分子也可以作為治療卵巢癌的靶分子應用到卵巢癌的治療中。

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（收稿日期：2018-04-08 本文編輯：許俊琴）