內質網應激蛋白ATF4調控STAT3信號通路促進黑色素瘤細胞生長及轉移的研究

張學軍 亓發芝

[摘要]目的：探索內質網應激蛋白ATF4在黑色素瘤發生發展中的作用和機制。方法：運用熒光定量PCR技術分析對比黑色素瘤細胞系和黑色素細胞系內ATF4表達的差異，運用CCK-8染色以及BrdU染色檢測細胞生長及增殖能力，運用Tranwell技術檢測細胞轉移能力，運用免疫印跡技術檢測細胞內STAT3磷酸化水平。結果：ATF4 mRNA在黑色素瘤細胞中的表達水平顯著高于黑色素細胞，顯示腫瘤細胞中含有更高水平的ATF4 mRNA；在A375細胞中過表達ATF4后，細胞生長增殖速率提高，轉移能力增強，而降低內源ATF4后，MM200細胞的增殖速度和轉移能力都出現明顯降低。同時，A375細胞內ATF4含量的增加也引起了細胞內STAT3磷酸化水平以及細胞內IL-6表達的顯著升高。結論：內質網應激蛋白ATF4在黑色素瘤的發生發展中具有重要的調控作用，細胞內ATF4可能是參與調控了IL-6-STAT3信號通路，從而促進黑色素瘤細胞增殖和遷移。

[關鍵字]黑色素瘤；內質網應激；ATF4；腫瘤細胞增殖；腫瘤細胞侵襲；STAT3

[中圖分類號]R739.5 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）07-0083-04

Abstract： Objective To explore the role of endoplasmic reticulum （ER） stress protein ATF4 in cell proliferation and metastasis of melanoma. Methods RT-qPCR was applied to investigate the levels of mRNA expression. CCK-8 staining and BrdU staining were introduced to determine the abilities of cell growth and proliferation. Transwell system was used to detect the metastasis ability of cells. Immunoblotting was conducted to determine the protein levels in cells. Results The levels of ATF4 mRNA significantly increased in melanoma cell lines when compared to melanocytes. Ectopic expression of ATF4 efficiently enhanced the proliferation and metastasis of A375 cells. Abrogation of ATF4 in MM200 impaired cell growth and metastasis. Furthermore， ATF4 overexpression upregulated the expression of IL-6 and subsequently activated STAT3 signaling. Conclusion In general， our results revealed that ATF4 regulated cell proliferation and metastasis via activating IL-6-STAT3 signaling in melanoma.

Key words： melanoma； endoplasmic reticulum stress； ATF4； tumor cell proliferation； tumor cell invasion； STAT3

黑色素瘤，通常又稱惡性黑色素瘤（malignant melanoma），是一種常見的惡性皮膚腫瘤，生長迅速。由于血管生成相對緩慢而容易造成營養和能量的供給不足，高速生長時期的黑色素瘤細胞內可能會發生多種應激狀態，為應對這些生存環境的不利局面，細胞需要合成大量的蛋白（特別是分泌蛋白）去緩解外界生存環境的困局，而短時間內大量蛋白的合成給內質網（Endoplasmic reticulum， ER）帶來了翻譯和修飾的壓力，會造成內質網內出現大量未折疊蛋白或者錯誤折疊蛋白的積累，從而產生內質網應激（ER stress）[1]，內質網應激會激活細胞內未折疊蛋白信號通路（The unfolded protein response pathway， UPR pathway）[2-4]。

近年來，越來越多的研究報道揭示了在腫瘤的發病過程中，UPR信號通路的關鍵作用[5-6]。在多種腫瘤的生長以及轉移過程中，PERK-eIF2-ATF4信號突進都扮演著重要角色。腫瘤細胞中PERK-eIF2通路得不到有效激活，ATF4蛋白產生量過少時，腫瘤細胞在體外和體內的生長都會受到抑制[7-9]；在腫瘤細胞中敲除或者降低內源ATF4細胞的表達，可以有效抑制移植腫瘤的生長[7]，更有意思的是，如果在腫瘤細胞內過表達ATF4，細胞對多種抗腫瘤藥物（如Cisplatin， Doxorubicin， Vincristine以及Etoposide）的抗性明顯加強，體現了ATF4在腫瘤藥物抗性中的重要作用[10-12]。此外，該信號通路在腫瘤細胞轉移方面也有著重要功能，在乳腺癌中敲除PERK后，腫瘤細胞的轉移能力明顯受到抑制[9]，而ATF4作為PERK下游重要分子，在腫瘤的轉移以及EMT中也起到非常關鍵的調控作用[13-14]。包括PERK-eIF2-ATF4通路在內的UPR信號通路在黑色素瘤中也扮演著重要角色，抑制細胞內PERK蛋白的活性，可以有效降低黑色素瘤的轉移[15]，但是具體的分子機制仍不清楚。黑色素瘤細胞不同于正常皮膚細胞一個主要特點是：細胞快速生長需要有大量的新蛋白產生，從而可在細胞中引起內質網應激，激活UPR信號通路[1，16-17]。因此對內質網應激蛋白ATF4在黑色素瘤中的功能和分子機制的充分研究有助于黑色素瘤的臨床治療以及藥物開發。本研究關注ATF4蛋白在黑色素瘤細胞增殖和遷移中的作用，初步探討ATF4調控黑色素瘤細胞增殖和遷移的分子機制。

1 材料和方法

1.1 細胞培養：黑色素細胞系（HEMn-MP和HEMn-DP）和黑色素瘤細胞系（Mel-CV， MM200， A2058， A375和SKMel-28）均購自于中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。所有細胞系均使用含10%胎牛血清（FBS，購自于Gibico公司）的DMEM高糖培養基（購自于Corning公司）培養，培養條件為37℃，5% CO2。

1.2 熒光定量PCR：熒光定量PCR檢測方法參考文獻[18]。細胞在經過相應培養或處理后，使用TRIZol（購自Invitrogene公司）固定細胞并按照產品說明提取細胞內總RNA，然后使用Takara公司RNA逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA。獲得的cDNA使用Power SyberGreen Mix試劑盒（購自ABI公司）進行熒光定量PCR檢測，檢測機器為ABI公司生產7900熒光定量PCR儀。

1.3 免疫印跡：免疫印跡技術檢測細胞中蛋白表達水平，具體方法參考文獻[19]。細胞在經過相應培養或處理后，使用RIPA固定并裂解細胞，細胞內蛋白制成樣品通過SDS-PAGE按蛋白相對分子量分離并轉移到醋酸纖維素薄膜上，薄膜使用10%脫脂牛奶封閉后，按照需要分別孵育相應蛋白的一抗（Primary antibody），在4℃孵育過夜，然后使用辣根過氧化物酶交聯的相應二抗（Secondary antibody）室溫孵育1h，最后使用免疫印跡顯色試劑盒（購自Thermo Fisherie Scientific公司）顯色。

1.4 CCK-8和BrdU染色檢測細胞增殖：Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購自Dajino公司，按照產品說明書檢測細胞增殖。在96孔板中接種相應細胞，每孔接種細胞數為1×103個，共分成6組，培養時間分別為4、24、48、72、96或120h，然后向相應組中加入CCK-8試劑，培養箱中繼續孵育2h，最后使用酶標儀讀取450nm的吸光度，以該吸光值為基礎計算成細胞數目。BrdU細胞增殖檢測試劑盒購自Cell Signaling Technology，按照產品使用說明書檢測細胞增殖情況。

1.5 熒光素酶報告實驗：本研究中使用熒光素酶報告基因實驗檢測ATF4對IL-6表達的調控作用，具體方法參考文獻[19]。將包含人源IL-6的啟動子的序列（2000bp）克隆到pGL3 basic質粒上，然后將該質粒與其它相應質粒共轉染到HEK293T細胞中，細胞裂解液使用Dual-luciferase Assay Kit（購自Promega公司），按照產品說明書檢測細胞中熒光素酶活性水平。

1.6 統計學分析：本研究所得結果，使用GraphPad 5.0軟件進行統計學分析和處理。所有實驗均進行3次以上，所有數據以（x?±s）表示，兩組數據比較采用Two-tailed Students t-test方法，兩組以上數據采用單因素方差分析（One-way ANOVA）或雙因素方差分析（Two-way ANOVA），P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ATF4 mRNA水平檢測結果：黑色素瘤細胞系Mel-CV、MM200、A2058、A375以及SKMel-28細胞中的ATF4 mRNA水平顯著高于正常黑色素細胞系HEMn-MP，差異有統計學意義（P<0.05），說明在這些腫瘤細胞中，ATF4 mRNA含量相對較高，ATF4活性升高，可能與黑色素細胞病變為腫瘤細胞密切相關，并有可能參與調控了腫瘤細胞包括增殖和轉移等特性相關。見圖1。

2.2 黑色素瘤A375細胞ATF4轉染結果：轉染可高表達人源ATF4的質粒，提高了該細胞中ATF4的表達水平（見圖2A）。CCK-8檢測結果顯示，A375細胞內ATF4含量增加后，細胞的生長速率顯著提高（見圖2B）；BrdU檢測結果顯示ATF4過表達促進了A375細胞增殖（見圖2C）。實驗結果說明，ATF4表達水平的提高可以促進黑色素瘤細胞生長及增殖；Transwell技術檢測細胞轉移能力，結果顯示ATF4水平提高可以顯著增加穿過小室薄膜的A375細胞數量，說明過表達ATF4可以增加黑色素瘤A375細胞的轉移能力，ATF4具有促進黑色素瘤細胞轉移的功能（見圖2D～E）。

2.3 黑色素瘤MM200細胞si-ATF4轉染結果：si-ATF4轉染黑色素瘤MM200細胞，特異性降低該細胞中內源ATF4的表達水平（見圖3A）。CCK-8檢測結果顯示，MM200細胞在ATF4降低后，細胞生長的速率明顯降低（見圖3B）； BrdU檢測結果顯示轉染si-ATF4的細胞增殖能力減弱（見圖3C）；Tanswell實驗結果顯示，隨著ATF4含量的降低，穿過小室薄膜的腫瘤細胞的數量顯著減少（見圖3D～E），說明降低細胞內ATF4水平可以抑制MM200細胞遷移能力。

2.4 黑色素瘤A375細胞中IL-6表達水平檢測結果：結果顯示過表達ATF4后，A375細胞中IL-6 表達水平顯著升高（見圖4A），進一步研究發現，ATF4過表達的A375細胞內STAT3蛋白磷酸化水平顯著升高（見圖4B），說明增加細胞內ATF4可以促進STAT3信號通路的激活。利用IL-6受體（IL-6 receptor，IL-6R）抑制劑Sarilumab特異性阻斷IL-6與IL-6R的結合，結果顯示Sarilumab可以有效抑制ATF4過表達引起的STAT3磷酸化的升高（見圖4B）。以上結果表明，黑色素瘤細胞中高水平的ATF4促進了細胞表達IL-6，從而提高細胞IL-6-STAT3信號通路的激活水平。

3 討論

UPR信號通路在黑色素瘤發生發展過程中起到重要作用，但是具體的分子機制至今仍不是特別清楚。本次研究結果顯示，相對于正常的黑色素細胞，黑色素瘤細胞中ATF4 mRNA水平顯著升高，具有轉錄激活活性的ATF4蛋白增多。在黑色素瘤細胞中提高ATF4水平，會促進細胞表達更多的IL-6，通過自分泌作用使細胞內STAT3信號通路激活。另一方面，升高細胞內ATF4的水平，可以有效提高黑色素瘤細胞增殖和遷移的功能，而降低內源ATF4的水平，則可以有效抑制黑色素瘤細胞的增殖和轉移。

ATF4是一種重要的轉錄激活因子，UPR信號通路激活后，大量表達的ATF4蛋白促進了多種基因的表達，從而緩解了內質網應激，重建內質網穩態[2，4]。而越來越多的研究發現，除調控內質網應激相關基因的表達外，ATF4還參與了調控了多種病理生理過程相關的基因表達。研究發現ATF4可以促進黑色素瘤細胞內IL-6 啟動子的轉錄活性，增加IL-6的表達和分泌，暗示ATF4可能是參與調控了IL-6的表達，詳細闡釋黑色素瘤細胞中ATF4參與IL-6表達調控的分子機制仍需要更多的研究結果。

有意思的是，用IL6受體抑制劑Sarilumab可以抑制ATF4高表達造成的細胞IL-6-STAT3信號通路的激活，這一結果提示黑色素瘤細胞表達的IL-6進一步通過自分泌或旁分泌作用激活了細胞內STAT3信號通路。以往的研究發現STAT3信號通路在多種腫瘤，特別是惡性腫瘤中，都處于高度激活狀態，而且在腫瘤細胞增殖和侵襲過程中都起到重要的作用[20-23]，在50%～90%的惡性黑色素瘤患者中，也發現了STAT3蛋白處于高度磷酸化狀態[22]，但是其具體原因和功能并不是十分清楚。本次研究結果顯示，黑色素瘤細胞內高水平的ATF4可能通過增加細胞IL-6的表達，從而提高細胞內STAT3信號通路的激活，而另一方面，增加的磷酸化STAT3可以促進黑色素瘤細胞的增殖和遷移能力，這可能是ATF4調控黑色素瘤細胞增殖和轉移的（部分）分子機制。在接下來的研究中，仍需做更多的研究工作，更好地闡釋ATF4促進黑色素瘤細胞增殖和轉移的具體分子機制。

綜上所述，黑色素瘤細胞內高表達的ATF4蛋白，具有促進黑色素瘤增殖和轉移的作用，而其通過調控細胞IL-6的表達和分泌，激活細胞內STAT3信號通路的激活，從而參與調控了黑色素瘤的發生發展過程。本次研究結果對黑色素瘤的臨床治療和藥物研發提供了很有價值的參考。

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[收稿日期]2018-04-28 [修回日期]2018-05-28

編輯/朱婉蓉