基于上轉換納米粒子與金納米粒子構建熒光共振能量轉移體系檢測雙酚A方法研究

許 宙 魯士珍 陳茂龍 朱穎越 丁 利 程云輝

(1. 長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410114；2. 常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500)

雙酚A是一種固化聚碳酸酯塑料和合成環氧樹脂的有機小分子物質[1]，其廣泛用于食品包裝容器、奶瓶、包裝材料、餐具和微波爐等的生產[2-3]。但BPA具有不穩定性，酸、堿環境和加熱等因素均會導致其遷移至所包裝的食品或飲料中[4]，使其廣泛存在于環境和食物鏈。同時，BPA是一種環境內分泌干擾物，可模擬雌激素的作用與雌激素受體結合干擾生物體內的激素代謝[5-6]，從而導致人和動物的生殖系統、神經系統[7]以及免疫系統等異常，甚至有可能誘發癌變[8-9]和威脅胎兒及兒童的生長和發育，使其出現出生缺陷，不孕、女孩早熟和肥胖等問題[10]。

目前，測定雙酚A的主要分析方法是高效液相色譜[11]、液—質聯用法、氣相色譜—質譜法[12-13]、熒光法[14-15]和酶聯免疫吸附法[16-17]等，其中常用的分析方法為色譜法和MS技術。這些技術能夠實現對雙酚A的高靈敏度分析，但需要專業人員操作、資本投入高、樣品制備和預處理復雜費時等要求限制了其在雙酚A檢測中的廣泛應用[18-19]，且無法滿足目前對檢測技術高速度、高通量、高便攜性的要求。因此，建立一種樣品前處理簡單、成本低、靈敏度高的雙酚A快速檢測方法具有重要意義。

熒光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)是當能量供體分子的熒光光譜與能量受體分子的激發光譜重疊時，2個熒光分子之間通過偶極—偶極相互作用發生非輻射能量躍遷，供體分子激發態的能量通過分子間的電偶極相互作用轉移給受體分子基態，從而使能量供體分子的熒光強度減弱或淬滅、出現熒光壽命縮短，與此相反，能量受體分子的熒光強度增加，熒光壽命延長的現象[20]。熒光共振能量轉移是一種均相分析檢測技術，具有靈敏度高，選擇性好、操作簡單方便等優點而廣泛應用于食品安全檢測領域。傳統的熒光供體通常是有機熒光染料，存在吸收光譜較窄，吸收峰和發射峰之間的斯托克斯位移較小等缺陷。而上轉換熒光納米材料是使用近紅外光(980 nm或者880 nm)作為激發光源，發射光在可見光區域分布，具有寬廣的吸收光譜，斯托克斯位移較大等特點，并可以克服生物組織或者復雜樣品自身熒光干擾，降低了檢測體系中的信噪比。因此，上轉換納米材料是理想的熒光共振能量轉移體系能量供體。

本研究擬利用適配體核苷酸的堿基互補配對作用，驅動適配體功能化AuNPs和適配體互補鏈功能化UCNPs進行組裝，將適配體對BPA的識別過程轉化為檢測體系熒光發射強度變化，建立高選擇性、高靈敏度的BPA檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

YCl3·6H2O(99.99%)、YbCl3·6H2O(99.99%)、ErCl3·6H2O(99.99%)、油酸(OA)、1-十八烯(ODE)、聚丙烯酸(PAA，相對分子量5 000)：北京百靈威科技有限公司；

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽(suflo-NHS)：98%，上海麥克林生化科技有限公司；

氫氧化鈉、氟化銨、檸檬酸三鈉、氯金酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：≥99%，國藥集團化學試劑有限公司；

氯化鈉、氯化鉀：≥99%，廣東光華科技股份有限公司；

十二烷基磺酸鈉(SDS)：99%，合肥博美生物科技責任有限公司；

實驗室用超純水：18.2 MΩ·cm的Millipore制備；

其他試劑：分析純，市售；

熒光分光光度計：F96PRO型，上海棱光技術有限公司；

激光發射器：MDL-III-980-2W型，中國長春新產品光電技術有限公司；

磁力攪拌電熱套：ZNCL-TS型，河南鞏義市宏華儀器設備有限公司；

透射電子顯微鏡：JEOLJEM-2100型，日本電子株式會社；

紫外可見分光光度計：UV-1800型，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 水溶性上轉換納米材料的制備 按照Li等[17]報道的合成方法制備油溶性上轉換納米材料：稱取YCl3·6H2O 0.236 g、YbCl3·6H2O 0.077 g、ErCl3·6H2O 0.007 g(Ln：78% Y3+、20% Yb3+、2% Er3+；共計1 mmol)加入到100 mL 三頸燒瓶中，加入4 mL OA和15 mL 1-ODE，1 500 r/min 磁力攪拌同時逐漸升溫至130 ℃，氮氣保護以除去環境中的空氣和水蒸氣，進一步升溫至160 ℃，至混合物形成均一溶液后自然冷卻至室溫；準確稱取0.13 g NaOH和0.13 g NH4F溶于10 mL甲醇中，將上述溶液逐滴加入到三頸燒瓶中，磁力攪拌30 min至反應體系充分混合，隨后緩慢加熱以蒸發甲醇，再逐漸升溫至300 ℃，氮氣保護加熱1 h后，溶液自然冷卻，產品用乙醇從溶液中沉淀出來，乙醇/環己烷(體積比5∶1) 清洗3次，烘干，即得NaY0.78F4:Yb0.2；Er0.02油溶性上轉換熒光納米材料。

油酸包覆的上轉換熒光納米材料由于油酸分子的烴鏈起疏水作用，材料在水中的分散性極差，需要對該材料表面進行PAA修飾。本研究按照Dai等[21]報道采用配體交換法制備PAA包裹的水溶性上轉換熒光納米材料：10 mL PAA分散在乙醇溶液(～20 mL wt 99.8%)中，5 mL OA-UCNPs分散在氯仿(～10 mL wt 99.8% )，然后將乙醇溶液加入到氯仿中，隔夜攪拌。再用乙醇清洗3次，最后將上轉換熒光納米材料分散在水中。

1.2.2 金納米顆粒的制備 根據文獻[22]記錄采用檸檬酸三鈉還原氯金酸(HAuCl4)法來合成金納米顆粒，步驟如下：取超純水97.5 mL以及質量濃度為0.412% (10 mmol/L)的HAuCl4溶液2.5 mL加入到有磁性攪拌子的潔凈錐形瓶中，采用磁力加熱攪拌器，攪拌、加熱至沸騰，7～8 min 后，加入質量濃度為1%的檸檬酸三鈉溶液2 mL，溶液從無色變為酒紅色，保持10 min，然后停止加熱，但保持原來的磁力攪拌狀態；維持15 min后從磁力加熱攪拌器上取下錐形瓶，所得酒紅色液體即為13 nm AuNPs。

1.2.3 金納米探針的制備 利用BPA適配體取1 mL制備得到的AuNPs溶液高速離心得到AuNPs沉淀，然后分散在1 mL 10 mmol/L pH 7.4 PBS緩沖液中，加入BPA適配體溶液(DNA1)10 μL，振蕩混合后搖床孵育過夜，反應結束后，溶液用12 000 r/min離心15 min，棄上清，保留底部暗紅色的AuNPs-DNA1探針，重懸于SDS溶液中，于4 ℃冰箱中儲存備用。

雙酚A適配體序列5端巰基：5-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCAT-CACGGGTTCGCACCA-3。

1.2.4 上轉換熒光納米探針的制備 稱取10 mg PAA修飾的NaYF4：Yb0.2，Er0.02UCNPs(PAA-UCNPs)分散在5 mL 10 mmol/L PBS(pH 7.4)緩沖液中，超聲充分分散，加入200 mmol/L EDC和100 mmol/L sulfo-NHS溶液各100 μL，37 ℃搖床活化2 h。之后加入一定量的BPA適配體互補鏈(DNA2)，在37 ℃搖床中孵育過夜，離心收集材料，用PBS緩沖液清洗3次，將最后得到的核酸適配體互補鏈修飾的功能化UCNPs(UCNPs-DNA2)分散在0.01% SDS溶液中，UCNPs-DNA2的濃度為2 nmol/L。

互補鏈5端氨基修飾：5-CCCACCTGACCACCCAC CGG-3。

1.2.5 檢測體系的構建 用超純水配制所需濃度的BPA標準溶液(1.0×10-3，1.0×10-4，1.0×10-5，1.0×10-6，1.0×10-7，1.0×10-8，1.0×10-9mol/L)，各取10 μL加入到制備好的功能化金納米探針(AuNPs-DNA1)中，室溫下振蕩孵育3.0 h；離心分離去除未反應的雙酚A，水洗3次重懸于500 μL 的0.01%的SDS緩沖液中，制備得AuNPs-DNA1-BPA納米粒子；向上述溶液中加入500 μL制備好的功能化UCNPs(UCNPs-DNA2)，混合均勻，室溫下振蕩孵育1.0 h后，用激光發射器980 nm激發檢測體系，紫外-可見分光光度計檢測其在500～700 nm波長范圍內的熒光強度。

2 結果與討論

2.1 檢測原理

檢測原理如圖1所示。通過BPA適配體功能化修飾的AuNPs與雙酚A發生特異性識別，當檢測體系中沒有BPA存在時，功能化AuNPs與功能化UCNPs通過DNA雜交作用進行結合；反之，當體系中存在BPA時，BPA會與適配體功能化AuNPs發生競爭性結合，導致功能化AuNPs從UCNPs表面脫落。隨著BPA濃度的升高，功能化UCNPs與功能化AuNPs結合形成組裝體的程度逐漸降低，使用激光980 nm 激發檢測體系，隨著組裝體組裝程度降低，在發射光543 nm波長處特征峰的光強度逐漸增強，據此建立基于FRET原理的金納米粒子淬滅上轉換熒光的BPA檢測傳感平臺。

圖1 熒光共振能量轉移體系檢測雙酚A原理圖Figure 1 Schematic diagram of FRET sensor for detection BPA

2.2 功能化AuNPs和UCNPs納米材料的表征

透射電鏡分析是納米材料最重要的表征手段之一，可以直觀地反映納米材料的形貌、粒徑和分散性等狀態。其中，材料粒徑過大易導致聚沉而無法滿足檢測要求；分散性是該傳感器建立的重要條件，直接影響納米材料的功能化修飾和特異性競爭結合的結果。圖2、3是透射電子顯微鏡(TEM)和水合粒徑儀(DLS)對適配體功能化AuNPs和互補鏈功能化UCNPs的表征結果。從圖2可觀察到，功能化UCNPs和AuNPs均呈現出良好的分散性，并且顆粒大小相對均勻、一致，其平均粒徑分別為120，13 nm。當體系中不存在雙酚A時，UCNPs表面的適配體互補鏈會與金納米粒子表面的適配體發生特異性結合，如圖2(c)所示。

從圖3(a)、(b)可觀察到功能化UCNPs和AuNPs均呈正態分布，說明2種材料均呈現良好的分散性且顆粒大小相對均勻，其平均粒徑分別為92，23 nm，分散性和粒徑均滿足下一步組裝要求。在圖3(c)中顯示，組裝后形成的UCNPs-AuNPs復合物的平均粒徑分布范圍為30～820 nm，基本對應AuNPs-DNA1和UCNPs-DNA2數據的加和，說明功能化修飾的UCNPs-DNA2和AuNPs-DNA1通過堿基互補配對原則發生DNA雜交，形成UCNPs-AuNPs復合物，滿足形成FRET原理中縮短供受體之間的空間距離的要求。

2.3 BPA測定

通過BPA與AuNPs表面的適配體特異性結合改變檢測體系中功能化納米材料組裝程度，考察不同濃度的鎘離子對應熒光強度的影響，由圖4可知，在檢測體系中加入BPA后，檢測體系在543 nm處的特征峰熒光強度逐漸提高。由圖5可知，檢測體系在543 nm處的特征峰值與BPA濃度之間存在線性關系y=18.967ln(x)+539.36(R2=0.992 3)，檢出限為1×10-10mol/L。

圖2 功能化UCNPs、功能化AuNPs、UCNPs-AuNPs 復合物的透射電鏡圖

Figure 2 TEM of functionalized UCNPs, functionalized AuNPs, assembled nanocompositec

圖3 功能化UCNPs、功能化AuNPs、UCNPs-AuNPs復合物的水合粒徑圖Figure 3 DLS of functionalized UCNPs, functionalized AuNPs, assembled nanocompositec

圖4 不同BPA濃度對應的熒光發射光譜圖

Figuer 4 A typical recording output for the detection of different concentrations of BPA by the developed method

圖5 BPA濃度與543 nm處的熒光信號強度的線性關系

Figuer 5 Standard curve of the fluorescence at 543 nm versus BPA concentration by the developed method

2.4 特異性分析

為了評價本方法對雙酚A的檢測特異性，采用多種BPA結構類似物檢驗檢測體系，如對苯二甲酸二辛酯(DOTP)、己二酸二(2-乙基己基)酯(DEHA)、雙酚F雙(2,3-二羥基丙基)醚(BFDGE)、雙酚A二(3-氯-2-羥基醚)醚(DOA)、雙酚F縮水甘油醚(BDFGE)、4-辛基酚(4-OP)進行了分析檢測，添加濃度為1 μmol/L，在對照組中添加BPA(濃度為100 nmol/L)，結果如圖6所示，1 μmol/L BPA結構類似物回收率均低于5%，說明本試驗所構建的BPA適配體傳感器具有良好的特異性。

圖6 不同BPA結構類似物對傳感器的影響

Figuer 6 Different fluorescence response of the aptasensor at 543 nm to BPA and different BPA analogs

2.5 回收試驗

為了驗證所建立的上轉換-熒光共振能量轉移生物傳感器的實用性，本研究對牛奶和自來水樣品進行了加標回收試驗。在實際樣品中加入不同濃度的BPA，用本研究建立的上轉換-熒光共振能量轉移生物傳感器進行檢測，結果如表1 所示，自來水的回收率為95.6%～103.1%；經過前處理后牛奶樣品的回收率為91.2%～92.3%，說明本研究構建的生物傳感器適合用于自來水和牛奶的分析檢測。

表1 實際樣品(自來水、牛奶)回收率測定Table 1 Recoveries of BPA

3 結論

本研究利用雙酚A適配體功能化金納米粒子與適配體互補鏈功能化上轉換熒光納米粒子構建了一種基于熒光共振能量轉移原理的雙酚A檢測方法。方法最低檢測限為1×10-10mol/L，該方法相比于傳統熒光檢測方法可以克服樣品中生物組織帶來的熒光干擾，且前處理簡單快速，能夠獲得高回收率。為具有生物熒光背景的食品樣品提供一種快速檢測小分子危害因子的新思路。