靶向抑制miR- 21對多發性骨髓瘤細胞凋亡、增殖的影響及其作用機制的初步研究

宋慧慧,李原,馬鈺,凌孫凱歌，葛崢,黃培林

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009；2.東南大學附屬中大醫院 血液內科，江蘇 南京 210009)

多發性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一種起源于生發中心后B細胞并能夠產生單克隆免疫球蛋白的惡性增殖性疾病，是發病率位居第2位的血液系統惡性腫瘤，目前仍不可治愈[1]。近年來，隨著細胞遺傳學及分子生物學技術的不斷進步，微小RNA(microRNA, miRNA)調控MM細胞惡性克隆性特征的研究也取得了許多顯著性的結果[2]。miRNA是一類包含19～22個核苷酸的非編碼的小分子RNA，通過抑制靶基因的mRNA翻譯或直接降解mRNA來完成基因的轉錄后調控，超過50%的蛋白質編碼基因會受到miRNA的調控[3]。miRNA在調控腫瘤發病的過程中，既可以發揮致癌基因的作用，也可以對腫瘤產生抑癌作用，那些具備致癌功能的miRNA被稱為癌基因miRNA。有研究[3- 5]表明，miR- 21在胃癌、肝癌、結直腸癌等實體腫瘤中起到了致癌基因的作用。對血液腫瘤的研究發現，miR- 21表達上調與B細胞淋巴瘤發病相關[6]，同時miR- 21的高表達對MM的發生及耐藥性也起到了至關重要的作用，但具體機制尚不清楚。本研究以MM細胞株為研究對象，探討靶向抑制miR- 21表達對MM細胞生物活性的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

人源性骨髓瘤細胞株U266、MM.1S、RPMI8226、NCI- H929、IM- 9(購自American Type Culture Collection)，接種于含10%胎牛血清及青霉素(100 UI·ml-1)、鏈霉素(100 UI·ml-1)的RPMI- 1640培養液中，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內培養、傳代。

1.2 qRT- PCR檢測

分別收集對數期細胞株U266、MM.1S、RPMI8226、NCI- H929、IM- 9，用Fermentas試劑盒提取總的RNA，根據試劑盒說明逆轉錄mRNA為cDNA作為模板，通過qRT- PCR對miR- 21進行檢測，miR- 21引物由科佰生物有限公司設計并合成，根據說明配置PCR反應體系，反應條件為：95 ℃變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸60 s，共40個循環。

1.3 基因轉染

取對數生長期U266細胞，按6×105個·ml-1接種到6孔細胞培養板，分別加入20 μl Lipofectamine2000試劑、20 μl miR- 21抑制物和20 μl miR- 21抑制物陰性對照物，混勻靜置放置25 min，置于CO2培養箱中培養6 h后更換含10%胎牛血清的RPMI1640培養液進行培養，轉染miR- 21抑制物及miR- 21抑制物陰性對照物48 h后收獲細胞。本實驗使用抑制物終濃度為200 nmol·L-1。

1.4 CCK8法檢測細胞活性

取1×106個·ml-1U266細胞株，接種于96孔細胞培養板，分別轉染miR- 21抑制物及miR- 21抑制物陰性對照物，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養4 h 后，每孔加入CCK- 8溶液10 μl，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下避光作用6 h，測定450 nm波長處各孔吸光度(A)值(每個樣本設3個復孔，實驗重復3次)。按公式計算細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率(%)=(1-A抑制物處理組/A空白對照組)×100%

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

將U266細胞株種于6孔板，實驗分組：(1) 實驗組：轉染miR- 21抑制物的U266細胞株；(2) 陰性對照組：轉染miR- 21抑制物陰性對照的U266細胞株；(3) 空 白對照組：U266細胞株。48 h后收集實驗組、陰性對照組及空白對照組細胞，將3組細胞分別移入2 ml EP管中，離心后用冰凍PBS洗滌2次，加入細胞染液，室溫避光孵育10～15 min，混勻進行流式細胞檢測。

1.6 Western blotting檢測

收集U266細胞株、轉染miR- 21抑制物U266細胞株以及轉染miR- 21抑制物陰性對照物的U266細胞株，提取總蛋白。以100 g·L-1SDS- PAGE電泳分離，濕轉法轉膜，室溫下搖床封閉1 h，加入封閉牛奶稀釋的PTEN(1∶1 000)、FOXO1(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST充分洗膜后分別加入用TBST稀釋(1∶3 000)的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，室溫下搖床孵育1 h，TBST洗膜后化學發光法顯色，X線底片曝光，顯影、定影。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 各組細胞株miR- 21表達情況

qRT- PCR檢測骨髓瘤細胞株U266、MM.1S、RPMI8226、NCI- H929、IM- 9，以U6作為內參對照。NCI- H929細胞株miR- 21表達水平最低，U266、RPMI8226、MM.1S、IM- 9細胞株miR- 21相對表達量分別是NCI- H929細胞株的(35.68±2.77)倍(P<0.05)、(7.08±0.65)倍(P<0.05)、(3.88±0.32)倍(P<0.05)、(19.94±1.31)倍(P<0.05)。根據檢測結果選取U266作為研究對象。

2.2 U266細胞株轉染miR- 21抑制物的效率

用Lipofectamine2000將miR- 21抑制物及miR- 21抑制物陰性對照物分別轉入U266細胞株中，48 h后收集上述細胞，qRT- PCR檢測轉染后的miR- 21表達水平變化情況。miR- 21抑制物陰性對照組miR- 21相對表達量高于抑制物實驗組(1.015±0.14vs0.286±0.031,P<0.05)，轉染抑制率為71.8%。

2.3 miR- 21對U266細胞增殖的影響

U266細胞轉染miR- 21抑制物及miR- 21抑制物陰性對照物，CCK- 8實驗檢測結果顯示，轉染miR- 21抑制物實驗組細胞增殖抑制率為(53.04±0.02)%，與轉染miR- 21抑制物陰性對照組細胞增殖抑制率(20.89±0.17)%相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.4 miR- 21對U266細胞凋亡的影響

流式細胞檢測結果顯示，轉染miR- 21抑制物的U266實驗組細胞株凋亡率[(28.53±3.23)%]明顯高于轉染miR- 21抑制物陰性對照組[(5.12±0.63)%]，差異具有統計學意義(P<0.05)；然而，轉染miR- 21抑制物陰性對照組與空白對照組U266細胞凋亡率[(0.92±0.17)%]差異無有統計學意義(P>0.05)(圖1)，提示抑制了miR- 21表達的U266細胞株細胞凋亡顯著增加。

A.空白對照組；B.轉染miR- 21抑制物陰性對照組；C.轉染miR- 21抑制物組

圖1流式細胞術分析miR-21對U266細胞凋亡的影響

2.5 Western blotting檢測蛋白表達

轉染miR- 21抑制物的U266細胞PTEN、FOXO1蛋白表達水平顯著高于轉染miR- 21抑制物陰性對照組及空白對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)(圖2)，而陰性對照組與空白對照組之間的差異無統計學意義(P>0.05)，提示miR- 21調控了PTEN和FOXO1蛋白的表達，導致了MM細胞生物學行為的異常。

1.空白對照組；2.轉染miR- 21抑制物陰性對照組；3.轉染miR- 21抑制物組

圖2Westernblotting分析miR-21對U266細胞株相關蛋白表達的影響

3 討 論

MM是克隆的B細胞惡性疾病，以骨髓中漿細胞異常和不可控制的增殖、骨損害和免疫缺陷為特征。漿細胞的惡性增殖產生大量無功能的單克隆免疫球蛋白和(或)輕鏈，造成機體貧血、腎臟損傷、骨質破壞、嚴重感染以及高黏滯綜合征、凝血功能異常。迄今為止，它確切的發病機制尚不清楚[7- 8]。miRNA這種小分子RNA可以特異性識別靶mRNA的3′- 非翻譯區(3′UTR)并與之結合，引起靶mRNA的降解或翻譯抑制。miRNA常常通過與靶基因完全互補結合切割靶mRNA，也可以與靶基因不完全互補結合，進而阻止翻譯而不影響mRNA的穩定性。部分miRNA還同時具備雙重功能，與靶基因互補結合時直接靶向切割mRNA，與靶基因不完全結合時起調節基因表達的作用。miR- 21是由17q23.2染色體FRA17B脆性區域編碼而成，它發揮著癌基因的作用，通過調控靶基因的mRNA和蛋白表達，進而控制細胞的增殖、分化、侵襲等功能。其抑癌作用已經在多種實體腫瘤和部分血液系統腫瘤中得到證實[3- 6]。有研究[9- 12]結果顯示，miR- 21可以利用磷酸化、乙酰化、泛素化等作用介導PTEN的表達，而PTEN基因作為一種抑癌基因，具有磷酸酯酶活性及蛋白絡氨酸激酶活性，是公認的miR- 21靶基因，接受miR- 21的負性調控。PTEN基因在受到miR- 21調控的同時也影響著FOXO1的水平，它可以減少FOXO1的磷酸化，磷酸化后的FOXO1會被轉移出細胞核直接降解。FOXO1作為轉錄因子在調節細胞代謝、應激反應、細胞周期及凋亡方面均發揮著至關重要的作用。有研究[13]表明它可以減少腫瘤細胞的凋亡、促進其增殖，所以FOXO1蛋白的缺失被認為是導致惡性腫瘤細胞不可控性增殖的重要原因。近年來，FOXO1轉錄調控的異常與miRNA之間的內在相關性已經成為惡性腫瘤的研究熱點。

本研究中，我們選取了5株骨髓瘤細胞株中miR- 21表達最高的U266細胞作為研究對象。靶向抑制U266細胞miR- 21的表達水平，結果顯示實驗組與陰性對照組、空白對照組相比，實驗組細胞增殖抑制率明顯提高，而陰性對照組與空白對照組之間無顯著差異。流式細胞檢測結果也顯示出實驗組細胞與陰性對照組、空白對照組細胞凋亡比值的差異具有統計學意義。這與miR- 21在其他腫瘤中的報道基本一致，提示miR- 21在腫瘤細胞的生物學行為過程中發揮了癌基因的作用。Western blotting檢測結果表明，實驗組細胞株下調了miR- 21的表達水平，PTEN作為其靶基因，受到miR- 21的負性調控，所以PTEN蛋白表達增加，而高表達的PTEN弱化了FOXO1的磷酸化作用，使得FOXO1降解減少，故而其蛋白水平也相應升高。這一結果在陰性對照組及空白對照組中也得到了反向的證明。

綜上所述，miR- 21在MM細胞中發揮了癌基因的作用，減少miR- 21的表達可以抑制骨髓瘤細胞增殖，促進其凋亡。它可能是通過介導PTEN的水平進而影響下游FOXO1的轉錄功能，實現對骨髓瘤細胞的調控。本研究結果為MM的發病機制和臨床診療提供實驗依據，值得進一步深入研究。