阿司匹林對T2DM小鼠藥效作用的研究

高華山，代紅梅，佟偉霜

（平頂山學院，河南平頂山 467000）

糖尿病是引起阿司匹林抵抗（AR）最主要的因素。根據大量臨床治療顯示，糖尿病與AR有著非常密切的關系，與非糖尿病患者相比，糖尿病患者出現AR的概率明顯更高[1]。另有研究顯示，在糖尿病患者機體中血小板活性有顯著升高，導致其出現心血管的發病率較之普通人群高出了2～4倍[2]。另有報道表示，在為糖尿病提供阿司匹林干預的過程中，與男性相比，女性出現AR的概率明顯更高[3]。本研究在相關文獻研究基礎上，對2型糖尿病（T2DM）小鼠模型進行構建，通過對雌性與雄性小鼠周期性阿司匹林給藥，對其與藥效學相關的指標變化情況進行測定，旨在對糖尿病狀態下AR的情況進行探討，明確是否存在雌性、雄性差異。

1 材料與方法

1.1 動物與飼料

購入80只小鼠（8周齡，SPF級，C57BL/6J），其中雌性與雄性小鼠各40只，體重均為20～22 g。將80只小鼠分別關在10個籠子內，每籠各8只，動物在籠內自由攝入食物和飲水。高脂飼料（HFD）由筆者根據實驗需要執行調配，主要由玉米淀粉、碳酸鈣、復合維生素、豬油、大豆油和蔗糖等共同組合而成。

1.2 試劑與藥品

總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）試劑盒（默沙克生物）、空腹血清胰島素（FINS）、血栓素B2（TXB2）、6酮前列腺素F1a（6-keto-PGF1a）ELISA試劑盒（上海酶研生物科技）；白細胞介素6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）酶聯免疫吸附測定法（ELISA）試劑盒（上海康朗生物科技）；鏈脲佐菌素（STZ）、阿司匹林、檸檬酸、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）等（南京化學試劑）；生理鹽水（平頂山學院實驗室）等。

1.3 儀器與設備

酸度計（HANNA，pH211型）、雅培便攜血糖儀及其一次性血糖試紙、分析天平（AUW，120D）、超純水器（Milli-Q Gradient A10）、酶標儀（Powerwave 200）、低溫高速離心機（德國）等。

1.4 實驗方法

1.4.1 建模

根據相關文獻報道結果[4]，運用鏈脲佐菌素和高脂飼料誘導法（HFD/ST）完成T2DM動物模型建立。具體建模方法：取健康小鼠，對其進行持續7d適應性喂養，禁食12h后，采用乙醚行麻醉處理，進行眼底靜脈叢取血，對其相關指標進行測定。隨機選取20只小鼠，為其提供基礎性飼料，并設定為正常對照組，另60只小鼠均在取血4d后，禁食12h，對其體質量進行稱重，并經由腹腔為小鼠注射STZ（正常組注射緩沖鹽溶液）完成高血糖模型的復制，所有小鼠均在30 min內完成所有注射。

1.4.2 分組與給藥

完成腹腔注射后，繼續為小鼠進行3周相應飼料的喂養。將20只正常飼料喂養小鼠隨機分為正常組、正常+阿司匹林組，各組分別有小鼠10只，其中雌性和雄性小鼠各有5只，稱重標號；另60只高脂喂養復合腹腔注射小劑量STZ的小鼠同樣隨機分為2型糖尿病模型組（模型組）、模型+阿司匹林組。以灌胃的方式為小鼠提供阿司匹林，給藥劑量為每日13mg/kg（劑量根據70 kg成年人體表面積換算后得出），持續干預10d。

1.5 觀察指標

對各組小鼠的情況進行密切觀察，重點對其體重、狀態、飲水量、攝食量等情況進行觀察。在小鼠尾部進行采取，并對其空腹血糖進行測定，同時按照對其TC、FINS、IL-6、IL-1β水平進行測定，所有操作均嚴格按照試劑盒要求實施。取腹主動脈血500μL，按照流式細胞儀對其血小板CD629表達水平進行測定。取眼眶血0.5ml，按照反射免疫檢測法對其血漿TXB2、6-keto-PGF1a進行測定。

1.6 統計學分析

運用統計學軟件Stat View對數據進行統計分析，相關數據均以均數±標準差（x—±s）表示，并以運用Student’s t-test行組間差異檢驗。有顯著差異采取雙尾檢驗，P＜0.05即表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 小鼠基本情況

模型組小鼠表現出明顯的活動遲鈍，精神萎靡不振，飲水量與食物攝入量均有明顯增多，且尿量明顯增加，需每日對墊料進行更換，體重增長明顯。正常組小鼠精神狀態較佳，尿量、食物攝入量以及體重均表現為平穩增加。在為兩組小組提供阿司匹林干預后，均未觀察到明顯變化。

2.2 HFD/STZ誘導小鼠的體重、糖脂、胰島素水平變化

正常組與模型組小鼠對比顯示，兩組FBG、FINS、TG、TC與BW均有顯著差異，差異有統計學意義（P＜0.05），模型組的體重、糖脂指標與胰島素水平與正常組比較均有顯著升高，這表明本次T2DM模型成功，見表1。

2.3 HFD/STZ誘導小鼠的血清炎癥因子變化

正常組與模型組小鼠對比顯示，兩組IL-6、IL-1β均有顯著差異，差異有統計學意義（P＜0.05），模型組的IL-6、IL-1β水平與正常組比較均有顯著升高。見表2。

表1 HFD/STZ誘導小鼠的體重、糖脂、胰島素水平變化

表2 HFD/STZ誘導小鼠的血清炎癥因子變化

2.4 阿司匹林對小鼠血小板CD62P的影響

阿司匹林未干預與干預10 d血小板CD62P表達檢測結果分析結果見圖1。根據圖1來看，模型組雌性小鼠血小板CD62P顯著高于正常組小鼠，且差異有統計學意義（P＜0.05），這表明在2型糖尿病狀態下會致使雌性小鼠血小板CD62P活性增強。在為正常組小鼠實施阿司匹林干預后，雌性小鼠和雄性小鼠血小板CD62P均表現出下降（P＜0.05），這表明阿司匹林可有效控制血小板CD62P的活性。模型組小鼠在行阿司匹林干預后，其雄性小鼠的血小板CD62P也呈現為明顯下降（P＜0.05），但雌性小鼠與干預前比較無差異（P＞0.05），這表明阿司匹林干預后雄性小鼠血小板CD62P活性得到控制，而雌性小鼠表現出AR。

2.5 阿司匹林對小鼠血漿TXB2/6-keto-PGF1a水平的影響

阿司匹林未干預與干預10 d血漿TXB2/6-keto-PGF1a表達檢測結果分析見圖2。根據圖2來看，正常組雌性與雄性小鼠在行阿司匹林干預后，其血漿TXB2/6-keto-PGF1a均表現出下降，該結果與血小板CD62P檢測結果一致。模型組小鼠在行阿司匹林干預后，其雄性小鼠的血漿TXB2/6-keto-PGF1a也呈現為明顯下降（P＜0.05），但雌性小鼠在進行阿司匹林干預后，其表達出現了血漿TXB2/6-keto-PGF1a明顯升高（P＜0.05）。這表明阿司匹林干預后可較好地達到對雄性小鼠的抗血小板干預效果，但在雌性小鼠上其藥效學卻出現了明顯下降，故引起了相反的情況。

圖1 阿司匹林未干預與干預10 d血小板CD62P表達檢測結果分析

圖2 阿司匹林未干預與干預10 d血漿TXB2/6-keto-PGF1a表達檢測結果分析

3 討論

本研究通過為小鼠提供小劑量STZ與高脂肪飲食，使得模型組小鼠表現出了明顯的血糖升高、體重增加、血脂升高等糖代謝紊亂現象，同時其胰島素水平也有顯著增加，形成了胰島素抵抗，這與以往研究報道[5]所構建的模型結果相同，且也符合T2DM的臨床特征。血小板活化主要是受到前列腺素（PGI2）與血栓素（TXA2）之間比例的影響，其分別來源于血小板環氧合酶COX-1、血管內皮細胞COX-2，為此，本研究在對阿司匹林效應的評價中選取了TXB2/6-keto-PGF1a比值作為評價指標。CS62P是血小板后期活化階段非常關鍵的特異性標志物，當血小板被激活之后，血小板表面膜與其細胞質中的a顆粒相互融合，從而促使大量CD62P被迅速釋放，使其大量暴露在血小板表面。為此，通過該項指標的測定能夠充分體現血小板的活化情況。本研究在采取HFD/STA行誘導建模后，模型組的小鼠其血小板表面CD62P表達水平出現了顯著增加，特別是雌性小鼠尤其明顯，而通過對小鼠實施阿司匹林用藥干預后，正常組與模型組雄性小鼠均對阿司匹林表現出較好的藥效學效應，而雌性小鼠的血小板CD62P與TXB2/6-keto-PGF1a表達均未出現其應用的下降，反而出現了升高，其中TXB2/6-keto-PGF1a表達有統計學差異（P＜0.05），該結果與以往的臨床研究成果一致，與男性相比，女性更易發生AR[6]。但需要重視的是，在通過HFD/STA行誘導建模后，模型組的小鼠其血清IL-6、IL-1β水平均高于正常組，研究者表示[7]，糖尿病所表現出慢性炎癥特征，與血管內皮COX-2升高密切相關，這就為下一步AR形成機制的探索提供了新的思路。