藠頭離體培養(yǎng)及生長(zhǎng)條件優(yōu)化

許真

（鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品工程學(xué)院，河南鶴壁 458030）

藠頭（Allium chinense G. Don）又名薤，是石蒜科蔥屬多年生鱗莖草本植物，鱗莖數(shù)枚簇生，長(zhǎng)圓形，葉3～6片，傘形花序半球狀，原產(chǎn)我國(guó)長(zhǎng)江流域[1]，其適應(yīng)性較強(qiáng)，鱗莖色白，柔嫩多汁，含有較多的維生素C和微量元素，具有消食、防癌、消膩等功效。自然條件下能開(kāi)花，但由于雌雄配子體敗育，不能進(jìn)行有性繁殖，所以在生產(chǎn)上采用營(yíng)養(yǎng)繁殖。長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)繁殖，導(dǎo)致種性退化嚴(yán)重，病毒病嚴(yán)重，繁殖系數(shù)低，嚴(yán)重影響食用性和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)蔥屬植物的離體培養(yǎng)有巨大作用，迄今為止，利用組織培養(yǎng)技術(shù)獲得藠頭再生植株及鱗莖培養(yǎng)條件優(yōu)化的報(bào)道還較少，因此，利用組織培養(yǎng)技術(shù)建立一套完整、系統(tǒng)的藠頭脫毒快繁體系，研究影響鱗莖形成和生長(zhǎng)的外界條件，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大田二年生藠頭植株。

1.2 外植體消毒、接種及培養(yǎng)

大田采挖的藠頭，除去長(zhǎng)葉、根和外層枯葉，在自來(lái)水下沖洗干凈，放入加有清潔劑的水中浸泡20 min，在流動(dòng)的自來(lái)水下沖洗1 h。將洗凈的鱗莖浸泡于75%酒精中5 min，然后在濃度為0.1%的HgCl2（加入2滴吐溫）溶液中浸泡15 min，最后用無(wú)菌水沖洗7～8次。

將消毒后的鱗莖切成長(zhǎng)、寬、高均為5 mm的方形，每塊帶有小芽，接種于MS+1.0 mg/L BA+0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基上（瓊脂0.75%，蔗糖3%，pH 5.8，下同）。每個(gè)處理15瓶，每瓶5個(gè)外植體。光照14 h/d，光照強(qiáng)度 40 μmol/(m2·s)，培養(yǎng)溫度（25±1）℃，直至形成無(wú)根帶愈傷的芽叢。以下培養(yǎng)條件同。

1.3 叢生芽的誘導(dǎo)與增殖

將誘導(dǎo)出的芽叢切成帶有4～5個(gè)小芽，帶有愈傷組織的小塊，放入添加不同種類(lèi)和濃度激素組合（表1）的MS培養(yǎng)基中。

接種8周后觀察各處理對(duì)外植體誘導(dǎo)不定芽形成的結(jié)果，統(tǒng)計(jì)分化芽數(shù)和分化率。

1.4 完整再生植株的形成

挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的無(wú)根芽叢，切成帶2～3個(gè)芽，芽高3cm左右的帶愈傷組織的小塊，培養(yǎng)在添加NAA濃度分別為0 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L的MS生根培養(yǎng)基上，每5 d觀察一次生根狀況，記錄生根時(shí)間和生根率。

1.5 鱗莖生長(zhǎng)條件優(yōu)化

將帶有愈傷的無(wú)根芽叢切成帶2～3個(gè)芽，高2 cm左右的小塊，在溫度為25 ℃、30 ℃和35 ℃條件下，培養(yǎng)在MS+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)13周。

將帶有愈傷的無(wú)根芽叢切成帶2～3個(gè)芽，高2 cm左右的小塊，室溫下，在蔗糖濃度分別為5%、10%和15%的MS+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)13周。

每周對(duì)鱗莖形成和生長(zhǎng)狀況進(jìn)行觀察，記錄鱗莖的形成時(shí)間、鱗莖高、直徑和重量。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析方法

按單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2003，統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用DPS7.0版軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素種類(lèi)和濃度配比對(duì)不定芽誘導(dǎo)與增殖的影響

由表1可知，BA和NAA對(duì)藠頭芽的分化和形成具有很大影響。BA為1.0 mg/L，NAA為1.0 mg/L時(shí)分化率和出芽數(shù)均高于其他處理。1.0 mg/L BA+1.5 mg/L NAA誘導(dǎo)芽形成效果最好，平均每個(gè)外植體可增殖17.2個(gè)芽，與其他處理達(dá)到顯著差異水平。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，BA對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)具有促進(jìn)作用，不添加BA時(shí)，沒(méi)有愈傷形成，BA濃度越高形成愈傷組織越多。NAA對(duì)芽的形成有一定促進(jìn)作用，但對(duì)愈傷組織的形成無(wú)顯著影響。

表1 不同激素處理對(duì)不定芽分化的影響

2.2 再生植株的形成（生根誘導(dǎo)）

植物生長(zhǎng)激素NAA對(duì)藠頭根的誘導(dǎo)及生長(zhǎng)狀態(tài)有很大影響。無(wú)添加時(shí)，生根最慢。濃度為0.1 mg/L時(shí)生根最快，處理5 d后生根率就達(dá)70%，濃度為0.1 mg/L和0.5 mg/L時(shí)的平均生根數(shù)分別為6.5和6.8條；濃度為1.0 mg/L時(shí)生根數(shù)最多，生根誘導(dǎo)20 d后，平均每個(gè)外植體生根8.6條。由此可知，NAA具有促進(jìn)藠頭生根的作用，濃度不同對(duì)生根速度、生根率以及根的長(zhǎng)短都有影響。

2.3 不同溫度、糖度對(duì)鱗莖形成的影響

溫度是影響藠頭鱗莖形成與生長(zhǎng)的重要因子之一。在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，將藠頭幼苗分別培養(yǎng)在20 ℃、25 ℃和30 ℃三個(gè)溫度下發(fā)現(xiàn)（表2）：鱗莖在低溫下不易形成，在高溫時(shí)形成較快。溫度為30 ℃時(shí)所形成的鱗莖直徑、高、重量都顯著大于其他處理。研究還發(fā)現(xiàn)，鱗莖形成的速度與溫度呈正相關(guān)，溫度越高形成越快。20 ℃時(shí)10周左右鱗莖膨大，25℃時(shí)培養(yǎng)8周植株基部開(kāi)始膨大，30 ℃時(shí)5周形成鱗莖。

表2 不同溫度對(duì)鱗莖生長(zhǎng)的影響

糖是影響鱗莖形成的又一因素。試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，隨著糖濃度的增加，鱗莖的高直徑，重量都逐漸增大，濃度為5%時(shí)，測(cè)量指標(biāo)均為最小，濃度為15%時(shí)，測(cè)量值均為最大，10%與15%的差異不顯著，所以可選用10%的蔗糖濃度用于生產(chǎn)。

試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，鱗莖形成快慢與蔗糖濃度也呈正相關(guān)。濃度為5%時(shí)，培養(yǎng)8周后，鱗莖基部才逐漸膨大；濃度為10%時(shí)，6周左右鱗莖開(kāi)始膨大；濃度為15%時(shí)，4周后鱗莖出現(xiàn)膨大跡象。由測(cè)量值可知，蔗糖濃度高時(shí)，高與直徑比較小，形成圓球形鱗莖較多；濃度低時(shí)，鱗莖高與直徑比較大，形成偏長(zhǎng)型鱗莖較多。

3 討論

BA是組織培養(yǎng)中應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞分裂素之一，具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)不定芽形成的能力[2]，是誘導(dǎo)不定芽分化所必需的激素。NAA是最廣泛的生長(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)之一，對(duì)植物根的形成具有強(qiáng)大的誘導(dǎo)作用。離體條件下，以藠頭鱗莖盤(pán)為外植體，誘導(dǎo)不定芽的形成并不困難，但誘導(dǎo)效果與培養(yǎng)基中添加的植物激素種類(lèi)和濃度配比有直接關(guān)系。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)BA與NAA以適宜的濃度配合使用時(shí)，能有效誘導(dǎo)藠頭不定芽和根的分化，促進(jìn)生長(zhǎng)。但當(dāng)BA濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)抑制出芽數(shù)，出芽率呈降低趨勢(shì)，這與Ayabe的研究結(jié)論一致[3]。BA對(duì)愈傷組織的形成具有促進(jìn)作用，濃度越高形成愈傷組織越多。NAA對(duì)芽的形成有一定誘導(dǎo)作用，對(duì)愈傷組織沒(méi)有誘導(dǎo)性。NAA能誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生不定根，但不同濃度的NAA誘導(dǎo)效果差異顯著。NAA為0.1 mg/L時(shí)生根最快，隨著NAA濃度的升高，根的誘導(dǎo)率和成根數(shù)都在下降。激素類(lèi)物質(zhì)的濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)對(duì)植物細(xì)胞、組織產(chǎn)生一定的毒害作用[4]。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低溫有利于藠頭葉和根的生長(zhǎng)[5]。高蔗糖濃度促進(jìn)根的生長(zhǎng)，根數(shù)和根長(zhǎng)都隨蔗糖濃度的升高而增加，葉長(zhǎng)和葉重隨糖濃度增加呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明高濃度糖對(duì)根的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用，對(duì)植株生長(zhǎng)影響不大。在較高的蔗糖濃度下，多形成單株植株，叢生苗較少。