西藏高原青稞中真菌毒素高效液相色譜串聯質譜法檢測技術研究

張一帆 魏娜 張飛龍

摘 要：研究建立高效液相色譜-串聯質譜聯用技術檢測青稞中黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、T-2毒素、伏馬毒素（FB1）9種生物毒素的方法。樣品采用酸化乙腈溶液提取，以2mmol/L（含0.1%甲酸）乙酸銨-甲醇（70：30，V/V）為流動相，采用正負離子模式對9種毒素進行檢測。結果回收率在78.6%～113.6%之間。該方法準確性好、靈敏度高、抗干擾能力強，能滿足我國食品安全標準的相關要求。

關鍵詞：青稞；液質聯用；真菌毒素；多組分檢測

中圖分類號：S-3 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20180631002

真菌毒素是由曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀菌屬（Fusarium）、青霉屬（Penicillium）、鏈格孢屬（Alternaria）等真菌產生的有毒次級代謝產物，廣泛污染谷物、食品以及飼料等，可致癌、致畸、致突變，威脅人畜健康[1]。目前，已發現超過400種真菌毒素，其中黃曲霉毒素（Aflatoxins， AFT）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol， DON）、玉米赤霉烯酮（zearalenone， ZEN）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A， OTA）、伏馬毒素（fumonisin， FB）、T-2毒素等是污染谷物的主要真菌毒素，可發生在作物田間生長階段或收獲后儲藏階段[2，3]。

目前國內外檢測真菌毒素的方法主要有薄層層析法、高效液相色譜法、酶聯免疫吸附法等方法，其中HPLC是國際上檢測真菌毒素最常用的方法[4]。隨著現代分析儀器的發展，液質聯用技術廣泛用于玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素、伏馬菌素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等真菌毒素檢測 [5-9]。糧食中真菌毒素污染形式往往是多種真菌毒素的共同污染，但目前采用液質聯用檢測真菌毒素的方法多為單組分檢測或同類毒素檢測。液質聯用采用選擇離子監測技術，可大大提高檢測的靈敏度和特異性，前處理技術可比傳統方法更為簡便，是同時檢測多種真菌毒素的理想方法。為此本研究利用液相色譜、三重四級桿質譜儀聯用對糧食中多種真菌毒素的檢測技術進行研究，旨在建立多組分準確、靈敏真菌毒素檢測技術方法，準確甄別、掌控糧食中真菌毒素的含量水平，為糧食安全監測與評估、食品安全有效監管工作提供有力的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

色譜純乙腈、色譜純甲醇、色譜純甲酸、分析純冰乙酸。AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、DON、ZEN、OTA、FB1、T-2毒素母液從ROMER公司采購，母液濃度分別為2mg/kg、0.5mg/kg、2mg/kg、0.5mg/kg、100mg/kg、100mg/kg、10mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，在-20℃避光下保存，有效期6個月。

1.2 儀器與設備

配有電噴霧（ESI）離子源的高效液相色譜-串聯質譜聯用儀、渦旋混合器、高速離心機、搖床、旋轉蒸發儀、超聲波清洗儀、資生堂C18色譜柱。

1.3 測定方法

1.3.1 色譜條件

資生堂C18色譜柱（MGⅢ-H，100 mm?2.1 mm， 3μm），柱溫為30 ℃，進樣量為1μL，流動相A為2mmol/L（含 0.1%甲酸）乙酸銨，B為乙腈（含 0.1% 甲酸）；梯度洗脫程序見表1。

1.3.2 質譜條件

電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），正離子模式和負離子模式。選擇反應監測（SRM），噴霧電壓為5500V，鞘氣為60psi，輔氣為55psi，離子源溫度為550℃。

1.4 樣品前處理方法

1.4.1 樣品提取

準確稱取均質后的樣品 5.00g（精確到0.02g）于50mL具塞聚丙烯塑料離心管中，加入10mL水充分浸潤之后，再加入10mL的10：90 甲酸/乙腈，充分振蕩，旋渦。將離心管平置放入搖床，室溫下搖床1h。加入 QuEChERS 鹽包，用手大力振蕩離心管 1min，在8800轉/min的速度下，離心5min，取上清液過玻璃微纖維濾紙過濾，收集濾液。

1.4.2 樣品凈化

準備 PRi MEHLB 小柱（6cc，200mg），無需活化平衡，吸取1mL樣品濾液直接加入SPE小柱，待流干后加入0.5mL乙腈洗脫，吹干，收集全部流出液。

1.4.3 溶劑轉換

流出液在40℃下氮氣吹至近干，乙腈水溶液（1：1）定容到 1mL，過0.22μm有機濾膜，上LC-MS/MS 測試。

1.4.4 標準工作曲線制作

分別吸取不同體積真菌毒素標準母液，逐級稀釋，用乙腈至刻度線，配制成濃度為含AFB1、AFB2 、AFG1、AFG2、OTA為100μg/kg；含T-2、DON、FB1、ZEN為500μg/kg的混合標準儲備液后，再用乙腈，分別稀釋配制出6個混合標準工作溶液點，避光 -20℃下保存，有效期7d。

分別吸取混合標準工作液，5μL、10μL、50μL、100μL、250μL、500μL、1000μL并用50%甲醇溶液（4.6）定容至1mL進樣小瓶中，AFB1、AFB2 、AFG1、AFG2、OTA上機濃度分別為0.5μg/kg、1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg，FB1、T-2、ZEN、DON上機濃度分別為2.5μg/kg、5μg/kg、25μg/kg、50μg/kg、125μg/kg、250μg/kg、500μg/kg，上機，繪制標準工作曲線。

2 結果與分析

2.1 色譜條件與質譜條件的選擇

2.1.1 色譜條件的選擇

采用MGⅢ-H（100 mm，2.1 mm，3μm）資生堂C18色譜柱對標準品進行分離，當流動相為2mmol/L（含 0.1% 甲酸）乙酸銨溶液-甲醇體積配比為70：30的時候響應值最好。

2.1.2 質譜條件的選擇

根據不同真菌毒素的分子質量和分子結構，選擇電噴霧離子源正負離子掃描模式注射進樣，對去簇電壓（DP）、射入電壓（EP）、碰撞電壓（CE）、碰撞室射出電壓（CXP）等條件進行優化，分別得出不同真菌毒素母離子、子離子和碰撞能量，見表2。

2.2 加標回收率

分別稱取3份樣品，每份5.00g，分別加入混合標準工作液50μL（上機濃度分別為5μg/kg或25μg/kg），按樣品預處理的方法進行提取和凈化后，高效液相色譜-串聯質譜進行測定，結果詳見表3。

2.3 方法精密度

在選定的色譜條件下，在同一天內連續5次測定混合標準溶液，每次20μL，測定各組分的峰面積，計算日內精密度。AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA、FB1、T-2、ZEN、DON的RSD分別為1.4%、2.5%、2.8%、3.1%、4.1%、3.6%、2.3%、1.8%、2.6%。連續5d分別測定混合標準溶液，每次20μL，測定各組分的峰面積，計算日間精密度。各真菌毒素的RSD為 3.3%～8.4%。

3 結論

本方法前處理過程簡單，檢測結果準確可靠，該方法可以一次性分析黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、OTA、FB1、T-2、ZEN等9種真菌毒素，靈敏度、穩定性能滿足我國食品安全標準的相關要求，為高原糧食中多種真菌毒素的污染定性和定量提供參考依據。

參考文獻

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作者簡介：魏娜（1983-），女，副研究員，研究方向：農業質量安全與標準研究。