不同基因型草魚呼腸孤病毒通用RT-PCR檢測方法的建立及應用

范玉頂，馬 杰，周 勇，江 南，劉文枝，曾令兵

(1.中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢 430223；2.愛達荷大學水產研究所魚類與野生動物科學系，莫斯科 83844-1136，美國)

草魚呼腸孤病毒(grass carp reovirus，GCRV)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)水生呼腸孤病毒屬(Aquareovirus)成員，是我國分離的第一株魚類病毒[1]。目前我國已報道的GCRV分離株有30多個[2-9]，根據基因序列差異可分為3個基因型：GCRV I、Ⅱ和Ⅲ型，其代表株分別為GCRV-873、GCRV-HZ08和HGDRV(原名GCRV104)[10,11]。

鑒于草魚出血病對我國草魚養殖業的巨大危害以及不同基因型GCRV分離株序列間的較大差異，國內外學者已建立了多種針對不同基因型GCRV的檢測方法[12-25]。但這些檢測方法大都針對特定基因型GCRV的某個節段設計特異性引物，所以一次反應只能檢測一種基因型的GCRV。要想覆蓋目前三種基因型的GCRV，需要設計多對引物或多個反應才能完成，使得檢測時間延長,檢測成本增加。Zeng等[12]于2013年建立了GCRV的三重PCR檢測法，該方法針對三種基因型GCRV分別設計了三對特異性引物，一次PCR反應就可以檢測三種基因型GCRV，大大提高了檢測效率。但近幾年陸續又有在多地鑒定到GCRV不同分離株的報道，而且有些新分離株在基因序列上與現有分離株存在著較大差異，所以綜合分析現有的GCRV分離株序列，建立一種簡單快速、可適用不同基因型GCRV的通用RT-PCR檢測方法就顯得尤為必要。

草魚呼腸孤病毒S2節段編碼的VP2蛋白是一種RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)，被認為是呼腸孤病毒科所有病毒蛋白中最保守的蛋白，也是該病毒科不同病毒屬在分子進化水平上進行劃分的標準蛋白；同一屬的呼腸孤病毒在該蛋白上的相似性>30%，水生呼腸孤病毒屬中同種病毒該蛋白的相似性一般>95%[26]。在前期研究中也發現，草魚呼腸孤病毒I～Ⅲ型毒株編碼的所有蛋白中，VP2蛋白的相似性最高，在44%～46%之間[4]。鑒于VP2蛋白在不同基因型草魚呼腸孤病毒間高度保守性，本研究根據GenBank登錄的草魚呼腸孤病毒S2節段，通過多序列比對分析，在保守區設計一對簡并引物，以期建立一種利用一對引物、一次PCR反應就能同時檢測三種基因型GCRV的通用RT-PCR 檢測新方法，并對該方法的反應條件進行優化，測試方法的特異性、靈敏性以及在臨床樣品檢測中的可靠性，為草魚出血病的快速診斷及流行病學調查提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 實驗用病毒

GCRV-GZ1208(I型)由中國水產科學研究院珠江水產研究所惠贈，GCRV106(Ⅱ型)、GCRV918(Ⅱ型)、GCRV-HeNan988(Ⅱ型)、HGDRV(Ⅲ型)、斑點叉尾鮰呼腸孤病毒(CCRV)、大鯢虹彩病毒(GSIV)、錦鯉皰疹病毒(KHV)、鯉皰疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)、鯉春病毒血癥病毒(SVCV)和傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)均由本實驗室分離并保存。

1.2 核酸提取

采用實驗室已建立的方法進行病毒核酸的提取[20]，即收集病毒感染的細胞，在-80 ℃和室溫條件下反復凍融3次，4 000 r/min 離心30 min(Sigma，3K-15),將上清轉移至35 mL 超速離心管中，20 000 r/min 離心2 h(Optima L-80XP，Beckman-Coulter),懸浮病毒沉淀備用。RNA病毒和DNA病毒核酸分別用Invitrogen公司的Trizol和DNAzol試劑進行提取，具體操作按試劑說明書進行。提取的病毒RNA和DNA分別保存在-80 ℃和-20 ℃冰箱備用。對于采集的草魚出血病疑似樣品核酸提取，參考實驗室已建立的樣品處理方法[27]，即收集病魚的肝、脾、腎等內臟組織于無菌培養皿中，用無菌眼科剪剪碎，加入10倍體積(V/W)的DPBS(Sigma)轉入玻璃均化器內并在冰浴下研磨成組織勻漿液，其他步驟同上。

1.3 引物設計

GenBank中含有S2節段全長的GCRV毒株共13株，其中Ⅰ型2株、Ⅱ型10株、Ⅲ型1株。具體毒株及S2節段Genbank序列號如下：GCRV-873(I型，AF284502.1)、GCRV- GZ1208(Ⅰ型，KU240075.1)、GCRV-HZ08(Ⅱ型，GQ896335.1)、GCRV-GD108(Ⅱ型，HQ231199.1)、GCRV106(Ⅱ型，KC201167.1)、GCRV918(Ⅱ型，KC201178.1)、GCRV-JX02(Ⅱ型，KM880066.1)、GCRV-HuNan794(Ⅱ型，KC238677.1)、GCRV- Huan1307(Ⅱ型，KU254567.1)、GCRV-AH528(Ⅱ型，KR180369.1)、GCRV-HeNan988(Ⅱ型，KC847321.1)、GCReV109(Ⅱ型，KF712476.1)、GCRV104(Ⅲ型，JN967630.1)。用CLUSTAL W進行S2節段多序列比較分析，在保守區設計一對簡并引物GCRV-F/GCRV-R；同時針對本實驗中用到的3株I～Ⅲ型GCRV分離株，在相同的S2節段保守區分別設計3對特異性引物(表1)。引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成，引物信息見表1。

表1 本研究所用引物信息

注:R= A/G;S=C/G;Y=C/T;D=A/G/T;M=A/C;W=A/T;V=A/G/C.

1.4 通用RT-PCR 擴增條件優化

使用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉錄試劑盒(TaKaRa，大連)合成cDNA模板，反轉錄引物為 Random 6 mers (50 μmol/L) 1μL，病毒RNA 8 μL，總體系20 μL，具體操作按說明書進行。PCR反應相關試劑均來自大連TaKaRa公司，其中使用的DNA聚合酶為TaKaRa Ex Taq?，總體系50 μL，包括：5 μL反轉錄產物，5 μL 10×Ex Taq Buffer (Mg2+Plus) (20 mmol/L)，4 μL dNTP Mixture (各2.5 mmol/L)，上、下游簡并引物各1 μL，0.25 μL TaKaRa Ex Taq (5 U/μL)，用超純水補齊至50 μL。其中上、下游簡并引物分別稀釋至10、20、30、40、50和60 μmol/L等6個工作濃度(對應的50 μL PCR反應體系中，上、下游引物終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1和1.2 μmol/L)以試驗最佳引物濃度。PCR反應參數按常規程序設置，共35個循環，使用梯度PCR儀(Biometra TProfessional standard gradient thermocycler，Germany)設置51、53.2、55.6、58和60 ℃等5個溫度梯度以試驗最佳退火溫度。反應結束后，取5 μL PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定最佳PCR條件。

1.5 靈敏度試驗

分別以GCRV-GZ1208(Ⅰ型)、GCRV106(Ⅱ型)和HGDRV(Ⅲ型)的cDNA為模板，利用表1中VP2基因的特異性引物進行PCR，擴增產物經膠回收純化后與pGEM-T easy克隆載體連接，構建三種基因型VP2的重組質粒。對重組質粒用EcoRI進行酶切鑒定，并送天一輝遠生物科技有限公司測序。用分光光度計測定三種重組質粒的濃度，參考文獻[20]的方法計算出質粒拷貝數：

質粒拷貝數(個/mL)=DNA質量濃度/DNA相對分子質量

其中：DNA質量濃度=260 nm吸光度×稀釋倍數×6.02×1023；

DNA相對分子質量=DNA堿基數×324.5。

用超純水將重組質粒進行10倍梯度連續稀釋，使其濃度依次為109～101拷貝/μL。以梯度稀釋的質粒做模板，結合前面研究獲得的最佳RT-PCR 條件，使用簡并引物進行PCR擴增,探討該方法的最低檢測限。

1.6 特異性試驗

使用本方法檢測GSIV、KHV、CyHV-2、SVCV、ISKNV和CCRV等其他魚類常見病毒，以及本實驗室保存的草魚呼腸孤病毒GCRV-GZ1208、GCRV106、GCRV918、GCRV-HeNan988和HGDRV，分析本方法檢測的特異性。其中GSIV、KHV、CyHV-2等DNA病毒核酸不需要反轉錄，直接用于PCR擴增；而SVCV、ISKNV、CCRV和GCRV等RNA病毒核酸要先進行反轉錄，然后以cDNA為模板進行PCR擴增。

1.7 臨床樣品檢測及鑒定

利用建立的通用RT-PCR檢測方法，對本實驗室于2015—2017年從湖北、江蘇、浙江、廣東等草魚主養區采集并保存的49份草魚出血病疑似樣品進行檢測，對于檢測結果為陽性的樣品通過TA克隆，每個樣品挑選8～10個陽性克隆測序，通過測序結果比對分析做進一步的毒株基因型鑒定，以此來判斷樣品的感染類型(單獨感染、混合感染)。

2 結果

2.1 GCRV S2節段保守區序列比對及簡并引物設計

通過13株GCRV分離株S2全長節段的多序列比對分析，發現一段長約590 bp序列在三種基因型GCRV中相對保守，尤其是在Ⅱ型的10株GCRV中這段序列保守性最高，只存在個別堿基的差異(圖1)。選取這段序列兩端最保守的位置設計一對簡并引物，從圖中可以看出，這對引物在I、Ⅲ型GCRV中擴增片段的預計長度分別為590 bp和587 bp，而在Ⅱ型GCRV中，除了GCRV-HZ08中擴增長度為593 bp外，其余均為590 bp(圖1)。

圖1 不同基因型草魚呼腸孤病毒S2節段保守區序列比對分析Fig.1 Multiple alignment of conserved nucleotide sequences of segment 2 from different genotype strains of GCRV“·”表示相同的核苷酸位點，“-”表示此位點為空格，方框部分為設計的簡并引物位置

2.2 GCRV S2保守區序列PCR擴增及重組質粒構建

分別以GCRV-GZ1208(Ⅰ型)、GCRV106(Ⅱ型)和HGDRV(Ⅲ型)的cDNA為模板，簡并引物和特異性引物PCR擴增結果完全一致，均得到了約590 bp的特異性條帶(圖2)。將簡并引物擴增得到的PCR產物克隆進pGEM-T easy載體，得到三種基因型GCRV的重組質粒(pGEM-1208、pGEM-106和pGEM-HGDRV)并用EcoRⅠ單酶切鑒定，酶切結果顯示均得到了大小約590 bp的插入片段，與預期大小一致，表明目的基因片段已正確插入到pGEM-T easy載體中(圖3)。重組質粒測序結果進一步證實，擴增得到的目的基因片段與GenBank公布的相應毒株參考序列的相似性達99%。

圖2 GCRV 的RT-PCR擴增電泳圖Fig.2 Amplification results of GCRV by RT-PCR assayM:DL2 000 bp marker；1：未加模板的陰性對照；2和5：GCRV-GZ1208(Ⅰ型)；3和6：GCRV106(Ⅱ型)；4和7：HGDRV(Ⅲ型)；1～4：簡并引物擴增結果；5～6：特異性引物擴增結果

圖3 GCRV重組質粒的EcoR Ⅰ酶切鑒定Fig.3 Restriction analysis of GCRV plasmids afterEcoR Ⅰ digestionM:DL5 000 bp marker；1：pGEM-1208質粒；2：pGEM-106質粒；3：pGEM-HGDRV質粒

2.3 通用RT-PCR 擴增條件優化

試驗的5個退火溫度(51、53.2、55.6、58和60 ℃)在三種基因型GCRV cDNA模板中的擴增效果基本一致，選取最高的60 ℃作為后續試驗的退火溫度。分光光度計測得重組質粒pGEM-1208、pGEM-106和pGEM-HGDRV濃度分別為150、100和150 ng/μL，計算出質粒拷貝數依次為3.8×1010、2.5×1010和3.8×1010拷貝/μL。選取109、107、105、103拷貝/μL等 4個10倍梯度稀釋的質粒為模板，試驗6個簡并引物濃度(10、20、30、40、50和60 μmol/L)的擴增效果。結果顯示(以pGEM-106質粒為例)：當質粒濃度較高時(如109

圖4 不同簡并引物濃度的RT-PCR在GCRV106中擴增電泳圖Fig.4 Amplification results of GCRV106 by RT-PCR assay with different concentration of degenerate primersM:DL1 000 bp marker；1：模板濃度為2.5×109拷貝/μL；2：模板濃度為2.5×107拷貝/μL；3：模板濃度為2.5×105拷貝/μL；4：模板濃度為2.5×103拷貝/μL

拷貝/μL)，不同濃度引物擴增均可得到較亮的目的條帶；而當質粒濃度較低時(如103拷貝/μL)，低濃度引物擴增沒有條帶或條帶很弱；引物濃度越高，在低濃度質粒中的擴增效果越好(圖4)。當簡并引物濃度為50 μmol/L和60 μmol/L時在四種濃度質粒中的擴增效果基本一致，故選取50 μmol/L作為PCR反應的最佳引物濃度(圖4)。其他兩種質粒的擴增結果與pGEM-106結果一致。

2.4 通用RT-PCR靈敏度和特異性試驗結果

根據以上最佳PCR擴增條件優化結果，使用95 ℃ 5 min 預變性，94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35個循環，72 ℃延伸10 min的PCR 條件；當質粒稀釋到102拷貝/μL時，在三種基因型GCRV模板中仍可擴增出相對較弱的特異性目的條帶(圖5)。即本方法對Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型GCRV核酸的最低檢測限分別為380、250和380個拷貝數。以三種基因型草魚呼腸孤病毒以及斑點叉尾鮰呼腸孤病毒(CCRV)的cDNA為模板均可以擴增得到預期大小的目的條帶,而以GSIV、KHV、CyHV-2、SVCV和ISKNV等其他魚類常見病毒核酸或反轉錄產物為模板均不能擴增出任何條帶(圖6)。

圖5 RT-PCR靈敏度試驗Fig.5 Sensitivity assay of the RT-PCR M:DL1 000 bp marker；1～9：質粒拷貝數分別為109～101 copies/μL；10：未加模板的陰性對照

圖6 RT-PCR特異性試驗Fig.6 Specificity assay of the RT-PCR M:DL1 000 bp marker；1～5:分別以GSIV、KHV、CyHV-2、SVCV和ISKNV的核酸或反轉錄產物為模板；6～11:分別以GCRV-GZ1208、GCRV106、GCRV918、GCRV-HeNan988、HGDRV和CCRV的反轉錄產物cDNA為模板；12：未加模板的陰性對照

2.5 臨床樣品檢測及鑒定結果

初步應用建立的通用RT-PCR檢測方法，對2015—2017年從湖北、江蘇、浙江、廣東等草魚主養區采集的49份草魚出血病疑似樣品進行檢測。PCR產物電泳結果顯示，49份樣品全部為陽性(圖7為部分樣品的檢測結果)，進一步測序結果顯示，Ⅰ型陽性樣品有4份，陽性率為8.2%；Ⅱ型陽性樣品有42份，陽性率為85.7%；Ⅲ型陽性樣品有1份，陽性率為2%；I、Ⅱ型混合感染陽性樣品有2份，陽性率為4.1%；其他類型的混合感染未檢測到。Blast結果表明，與GenBank已有毒株的序列相似性在98%以上。

圖7 部分臨床樣品RT-PCR檢測結果Fig.7 Results of detection by RT-PCR for partial suspected grass carp hemorrhagic samplesM:DL1 000 bp marker；1～15:分別以從湖北、江蘇、浙江、廣東等地采集的15份草魚出血病疑似樣品RNA反轉錄產物cDNA為模板；16：未加模板的陰性對照

3 討論

由草魚呼腸孤病毒(GCRV)引起的草魚出血病是一種嚴重的病毒性疾病，每年都會給我國草魚養殖業造成巨大損失，嚴重影響水產行業的健康發展[10]。簡單有效的GCRV檢測方法對于該病的有效防控具有重要意義。目前，研究學者已建立了多種GCRV的檢測方法，如傳統的細胞培養、電鏡觀察、SDS-PAGE等經典的檢測方法，但這些方法比較費時費力。隨著生物技術的快速發展，近年來很多學者建立了新的GCRV檢測方法，如real-time PCR[17-20]、RT-LAMP[21]、dsRNA測序法[22]、單克隆抗體檢測[23]、Western blot[24]以及曾偉偉等最近報道的NASBA-ELISA法[25]，這些方法具有靈敏度高、特異性強等優點，但大都存在操作復雜、周期長、依賴昂貴儀器設備以及成本較高的缺點。RT-PCR由于具有靈敏、特異、簡單、高效等優點在GCRV檢測中得到了廣泛應用[12-16]，但這些RT-PCR檢測方法中所用引物都是針對某種基因型GCRV的某個節段所設計的基因特異性引物，在不同基因型GCRV中不具有通用性。Seng等根據多種呼腸孤病毒S6節段設計了一對簡并引物可同時檢測多種水生呼腸孤病毒[16]，但通過我們前期研究發現，這對引物僅適用于Ⅰ型GCRV檢測，在Ⅱ型、Ⅲ型GCRV中擴增不出預期條帶。因此，我們嘗試設計一對通用的引物，通過一次RT-PCR反應就可以同時檢測三種基因型草魚呼腸孤病毒，從而達到簡化試驗操作、提高檢測效率和降低檢測成本的目的。

由于S2節段編碼的VP2蛋白是目前不同基因型草魚呼腸孤病毒中最保守的蛋白[4]，所以我們根據GenBank中可查詢到的13株GCRV毒株S2節段的多序列比對分析，對于所用引物中的非保守核苷酸位點采用了簡并堿基表示，在其保守區設計一對簡并引物，建立一種可同時檢測三種基因型GCRV的通用RT-PCR檢測方法。在前期預實驗中，我們共設計了4對簡并引物，綜合考慮引物的簡并性、特異性和擴增效果等因素，最終篩選到本試驗所用的這對最佳引物組合。退火溫度是影響PCR擴增特異性的一個重要因素，本試驗中的5個退火溫度擴增效果基本一致，由于較高的退火溫度可以減少非特異性帶的產生[12]，故選取其中最高的60 ℃作為通用RT-PCR的最佳退火溫度。引物濃度是影響擴增效率的重要因素；本研究發現，當模板濃度較低時，較低的引物濃度擴增條帶很弱甚至沒有條帶，而隨著引物濃度升高，擴增條帶越來越亮(圖4)；本試驗選定的最佳引物濃度是50 μmol/L(對應的PCR反應中引物終濃度為1 μmol/L)，略高于曾偉偉等[12]和郝貴杰等[13]所建立的檢測方法中引物濃度。因此，通過條件優化，本研究建立的通用RT-PCR的最佳退火溫度和引物濃度分別是60 ℃和50 μmol/L。

本研究建立的檢測方法對Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型GCRV核酸的最低檢測限分別為380、250和380個拷貝數，這一結果與曾偉偉等[12]三重PCR檢測方法中260、190和230個拷貝數的檢測限基本一致；王曉豐等[14]針對Ⅱ型GCRV建立的檢測方法其最低檢測限為180個拷貝數，也與本研究結果基本一致。采集的草魚出血病臨床樣品病毒含量一般都在500拷貝/μL以上[12]，表明該方法的靈敏度可以滿足臨床樣品檢測的要求。在已建立的GCRV熒光定量PCR檢測方法中，殷亮等[18]建立的Ⅰ型GCRV-JX0901 TaqMan Real-TimePCR檢測方法可檢測到4拷貝/μL；劉寶芹等[19]建立的Ⅱ型GCRV-HZ08的 FQ-PCR 檢測方法可檢測到6拷貝/μL；曾偉偉等[17]針對Ⅰ型、Ⅱ型GCRV以及周勇等[20]針對Ⅲ型GCRV建立的Real-Time PCR檢測方法的最低檢測限均為10拷貝/μL。與熒光定量PCR相比，本研究建立的RT-PCR檢測方法靈敏度要顯著低于前者，盡管質粒模板稀釋到102拷貝/μL時仍可以檢測到三種基因型GCRV，但擴增的條帶相對較弱(圖5)。對于病毒含量較低的臨床樣品，可能會出現檢測的假陰性或漏檢的情況，為此本試驗在樣品核酸提取步驟中，采取了超速離心濃縮病毒核酸的處理方式，通過提高病毒含量來盡可能減少假陰性的產生。此外，下一步考慮結合靈敏度更高的熒光定量PCR進行進一步的確認，或在現有簡并引物的內部設計一條或兩條簡并內引物，通過巢式或半巢式PCR進一步提高該方法檢測的靈敏度。

我們前期從患病的斑點叉尾鮰中分離鑒定出了斑點叉尾鮰呼腸孤病毒(CCRV)，該病毒基因組SDS-PAGE帶型分布特征與Ⅰ型 GCRV873株高度一致，且二者S4節段的相似性高達99%[27]。在特異性試驗中，本方法除了能夠擴增GCRV-GZ1208(Ⅰ型)、GCRV106(Ⅱ型)、GCRV918(Ⅱ型)、GCRV-HeNan988(Ⅱ型)和HGDRV(Ⅲ型)等不同基因型草魚呼腸孤病毒外，在CCRV中也擴增出了同樣大小的預期特異性條帶(圖6)，這與前期研究中CCRV與GCRV873高度同源的結論是一致的；但不能擴增GSIV、KHV、CyHV-2、SVCV和ISKNV等其他魚類常見病毒，表明該方法具有良好的特異性。此外，應用本方法僅對本研究室保存的GCRV毒株進行了特異性驗證，該方法在其他GCRV分離株中的適用性還有待于進一步驗證。

利用建立的通用RT-PCR對采集自全國草魚主養區的49份草魚出血病疑似樣品進行檢測，結合陽性克隆的測序鑒定，結果顯示全部為GCRV 陽性，而且Ⅱ型所占比例高達85.7%，Ⅰ型和Ⅲ型的比例分別為8.2%和2%，這與前人研究中Ⅱ型草魚呼腸孤病毒是目前主要流行株的結論是一致的[2,5,10,12]。曾偉偉等[12]通過86 份草魚出血病樣品流行病學分析，發現I、Ⅱ型和Ⅱ、Ⅲ型混合感染的陽性率分別為5.8%和2.3%，本研究僅檢出了I、Ⅱ型混合感染樣品，陽性率為4.1%，沒有檢測出其他類型混合感染樣品，這可能是由于所檢測樣品本身的差異或不同檢測方法的靈敏度差異造成的，也可能與本試驗中檢測的臨床樣品數量偏少、測序的陽性克隆數不多等因素有關。

總之，本研究基于簡并引物建立了一種新的草魚呼腸孤病毒 RT-PCR檢測方法，該方法只需一對引物、一次PCR反應就可以同時檢測三種基因型GCRV，具有通用性好、省時高效的顯著特點；同時還兼具較高的靈敏度和特異性。需要指出的是，由于該方法在三種基因型GCRV中擴增的條帶大小基本一致(587 bp、590 bp和593 bp)，所以無法通過瓊脂糖凝膠電泳區分GCRV基因型，只適合草魚出血病樣品的定性分析。GCRV基因型的確定需要通過后續的PCR產物克隆測序分析或結合曾偉偉等[12]建立的三重PCR法進行判定。因此本研究建立的通用RT-PCR檢測方法是對現有GCRV檢測方法的一個有益補充，可在草魚出血病臨床樣品的快速診斷及流行病學調查中發揮重要作用。