穿孔素基因在手足口病中的變異及臨床意義

郭義敏 ，路健 ，陳艷 ，王歡 ，羅果 ，許運斌

1.遵義醫學院附屬醫院小兒內二科，貴州遵義 563000；2.遵義醫學院醫學與生物學研究中心，貴州遵義 563000

手足口病（HFMD）是由腸道病毒引起的急性傳染病，多發生于5歲以下兒童。近幾年來，我國發生了大規模的HFMD暴發疫情，尤其是在疫情中EV71和Cox A16感染引起的神經性疾病的迅速增加，少數患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發癥，病情發展迅速,最終導致死亡[1-2]其原因可能為嬰幼兒免疫系統發育尚不成熟，免疫力普遍低下有關[3-4]。且目前使用激素及免疫球蛋白能取得良好效果[5-6]，故推測重癥手足口病的發生與免疫功能紊亂有著密切的關系。但是具體機制尚不清楚。穿孔素基為常見的免疫異?；颍菣C體內具有細胞毒作用的效應分子，儲存在細胞毒性T細胞（CTL）和NK細胞胞質顆粒中的糖蛋白，由于基因發生突變，不但T細胞及NK細胞數量及活性減低，其細胞功能也明顯下降，導致細胞因子大量產生，形成細胞因子風暴，從而導致器官功能異常，甚至死亡[7]。近年來研究發現在一些與免疫功能相關的疾病，如嗜血細胞綜合征、急性白血病等疾病中發現有穿孔素基因突變等，但是在重癥手足口病中有無異常尚未見報道，基于此，該研究方便選取2016年9月—2017年2月間80例手足口病患者與40名正常體檢者為研究對象，進一步了解穿孔素基因與重癥手足口病的關系，為降低重癥手足口病的發病率，降低致殘率及死亡率等提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選取在遵義醫學院附屬醫院兒科住院資料完整并符合診斷標準的患兒為實驗組，按病情輕重分為普通病例組（n=40例）、重型病例組（n=40例），同時隨機抽取健康體檢兒童40名為正常對照組，手足口病診斷標準參照《手足口病診療指南(2010年版)》[1]。各組患兒年齡、性別、身高、體重等方面均差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 納入標準

1.2.1 臨床診斷病例 ①流行季節3～10月，常見于5歲以下兒童。②發熱并伴有四肢或臀部皮疹或口腔皰疹。③重癥病例臨床診斷需要結合神經系統癥狀，并需要腦脊液等實驗室檢查結果支持。

1.2.2 重型病例組納入標準 ①符合手足口病臨床診斷，住院過程中出現神經系統受累的患者；②實驗室檢查結果支持重癥診斷結果；③自愿接受入院后病例隨訪和檢測的患者。

1.2.3 普通病例組納入標準 ①符合手足口病臨床診斷，住院過程中未合并神經系統受累癥狀的患者；②自愿接受入院后病例隨訪和檢測的患者。

納入病例均經醫院倫理委員會批準。

1.3 排除標準

①未完成隨訪、檢測者；②入院時合并肺出血、先天性心臟病、免疫缺陷者；③其他影響該研究的因素。

1.4 觀察指標

①分析試驗組與對照組的基因突變情況；②比較普通、重癥、危重癥組患兒的穿孔素，T淋巴細胞亞群、NK細胞數量、B淋巴細胞數量。

1.5 統計方法

數據采用SPSS 19.0統計學軟件進行處理和分析，計數資料和計量資料分別用所占比例和（±s）表示，組間比較采用χ2檢驗與t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

與正常對照組比較，普通病例組出現c.900C＞T(p.His300=)，同義突變（純合突變）4例，重型病例組出現14例，正常對照組3例。具體分布見表1。

表1 試驗組與對照組基因突變情況比較

3 討論

手足口病是由屬于小RNA病毒科的多種腸道病毒引起的傳染病，在皮膚科屬于常見疾病。手足口病的易感因素、發病機制認為與免疫有關,目前很多學者均認為，重癥手足口病的發生及發展，細胞免疫功能在其中發揮極其重要的作用，導致細胞因子大量產生，形成細胞因子風暴，從而導致器官功能異常，甚至死亡。王飛舟等[8]對7例重癥死亡患兒進行尸檢，結果發現脾臟及淋巴結嚴重破壞，見壞死破碎的細胞碎片及單核細胞吞噬現象，推測其免疫功能下降也是導致患兒加重或死亡的主要原因。張艷芳等[9]強調免疫功能異常時導致重癥手足口病非常重要的原因。方代華等[10]認為，免疫功能低下患兒感染EV71后更可能發展為重癥病例，同時強調一旦懷疑或診斷HFMD患兒，入院積極監測免疫功能，若出現異常，盡早干預治療，適時應用免疫球蛋白調節免疫功能及激素抗炎等對癥智聯，可控制病情及改善轉歸，減少死亡。王軍等[11]強調，NK細胞屬固有免疫，可分泌多種細胞因子和趨化因子，為抗病毒免疫的第一防線，提高NK細胞比例和增強NK細胞活性，有利于疾病的早期痊愈或減少心肌并發癥的發生。穿孔素(perforin）屬于成孔蛋白（PFP)是一種分子量為67kD,存在于細胞毒性T淋巴細胞(CTL)和NK細胞胞質的細胞毒顆粒中的糖蛋白。穿孔素基因為常見免疫異?；?，是機體內具有細胞毒作用的效應分子，儲存在細胞毒性T細胞（CTL）和NK細胞胞質顆粒中，兩種效應細胞與靶細胞接觸而激發顆粒胞吐，所釋放的穿孔素通過聚合作用而在靶細胞表面形成多聚穿孔素管狀通道，使顆粒酶進入靶細胞，導致靶細胞溶解破壞；穿孔素還可使一些顆粒分子如顆粒溶解素（granulysin）進入靶細胞內，對胞內感染發揮免疫作用[12-14]。周曉姮等[15]初步探討了PRF1基因突變與患兒免疫細胞功能和臨床表現的關系，結果顯示8例噬血細胞性淋巴組織細胞增生癥患兒中有3例存在PRF1外顯子編碼區雜合錯義突變，其中患兒及其父、兄或者母、弟的外周血CD8+T細胞穿孔素陽性率(0%～1.48%)和NK細胞穿孔素陽性率(8.69%～32.10%)與正常對照組相比有明顯減少。該次研究選取兒科住院資料完整并符合診斷標準的患兒為試驗組，按病情輕重分為普通病例組、重型病例組、同時隨機抽取健康體檢兒童為正常對照組，結果顯示，手足口病患兒中，c.900C＞T(p.His300=)，同義突變（純合突變），重型病例組14例，正常對照組3例，普通病例組出現4例，重型突變的比例顯著高于正常對照組和普通型患兒 （P＜0.05）。正常對照組NK細胞活性≤15%5例，普通病例組有13例，重型病例組有32例，其中重型出現比例顯著高于正常對照組與普通病例組（P＜0.05），由此可見隨著病情的加重，穿孔素基因突變增加，且NK細胞活性減低。由此可見，導致細胞免疫功能下降，均提示免疫功能的下降與穿孔素基因突變有關。

綜上所述,通過該研究觀察到重癥手足口病患兒的穿孔素基因c.900C>T(p.His300=)，同義突變（純合突變）的表達與病情嚴重程度成癥相關，NK細胞活性減低呈負相關，但具體的臨床意義還有待進一步深入探討。