miR-20b對自身免疫性肝炎小鼠肝臟的保護作用及機制

孟子愉，朱恩東

(天津醫科大學代謝病醫院內分泌研究所 國家衛生健康委員會激素與發育重點實驗室 天津市代謝性疾病重點實驗室，天津300070)

自身免疫性肝炎是由自身免疫反應介導的慢性進行性肝臟炎癥性疾病，其病因目前尚未明確[1～3]。糖皮質激素單用或與硫唑嘌呤聯用是目前治療自身免疫性肝炎的標準療法，但患者常出現血細胞減少、骨質疏松、糖尿病等不良反應。隨著對該病研究的逐漸深入，尋找新的治療方式成為研究熱點。微小RNA(miRNAs)是由20～25個核苷酸組成的非編碼RNAs，通過結合靶基因的3′UTR區引起mRNA降解，從而負向調控其功能。miRNAs可以影響細胞增殖、凋亡、黏附、遷移等生理過程，同時對惡性腫瘤的發生發展及免疫系統的調節發揮重要調控作用[4]。研究表明，miR-20b在T淋巴細胞白血病、乳腺癌及多發性硬化癥等疾病進程中均發揮調控作用[5～8]。但目前miR-20b在自身免疫性肝炎中作用的研究相對較少。2017年12月～2018年4月，我們采用刀豆蛋白(ConA)誘導小鼠自身免疫性肝炎，檢測血清和肝組織中炎癥因子水平，探討miR-20b對肝臟的保護作用，為自身免疫性肝炎的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 SPF級C57BL/6J品系野生型雄性小鼠52只，8～10周齡，體質量20～25 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司。HEK-293T細胞由本實驗室保存。Ⅳ型ConA、吐溫-20購于美國Sigma公司；ALT檢測試劑盒購于上海榮盛生物藥業有限公司；IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4 ELISA檢測試劑盒購于美國Biologend公司；TRIzol、Lipofectamine2000購于美國Invitrogen公司；Prime Script RT Reagent Kit反轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ購于日本TaKaRa公司；實時熒光定量PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成設計；DMEM/H培養基購于美國Hyclone公司；胎牛血清、Opti-MEM培養基購于美國GIBCO公司；Peg-It病毒濃縮液、miR-20b慢病毒構建及包裝相關質粒購于美國SBI System Biosciences公司。構建miR-20b慢病毒表達載體，點突變miR-20b與靶基因結合的種子序列而構建得到對照載體。

1.2 動物分組與造模 將小鼠隨機分成模型組16只、對照慢病毒組18只、miR-20b慢病毒組18只。模型組正常飼養，對照慢病毒組、miR-20b慢病毒組分別給予2×107U重組慢病毒對照載體和miR-20b慢病毒表達載體尾靜脈注射。7 d后三組均經尾靜脈注射ConA 15 mg/kg誘導自身免疫性肝炎模型。

1.3 血清ALT水平檢測 采用賴氏法。取模型組7只、對照慢病毒組9只、miR-20b慢病毒組9只小鼠，于造模后6、12、18、24、36、48 h分別眼靜脈取血，離心取血清。樣品孔和對照孔各3個復孔，每孔加5 μL血清。樣品孔加入25 μL基質液，對照孔不加。配制標準品溶液，每個濃度3個復孔，加入96孔板中，37 ℃恒溫水浴30 min。水浴后，所有孔均加入25 μL二硝基苯肼，對照孔再加入25 μL基質液，37 ℃恒溫水浴20 min。水浴后，所有孔均加入250 μL 0.4 mol/L NaOH終止反應。多功能酶標儀讀取波長在490 nm處吸光度值，按照標準曲線計算出血清樣品中酶活力單位。

1.4 肝組織病理學檢查 采用HE染色法。造模后18 h，三組分別取2只小鼠處死，留取肝組織(主要病變區)。加入4%甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，切成5 μm厚的切片。用玻片將蠟帶撈起，并使其貼在玻片上。晾干后進行HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察組織病理情況。

1.5 血清IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4水平檢測 采用ELISA法。造模后2 h，三組分別取剩余的9只小鼠，摘眼球取血，離心取上清液。ELISA檢測前1日，酶標板每孔加100 μL包被抗體，4 ℃過夜。次日每孔加入300 μL PBST洗板4次。每孔加入200 μL封閉液，室溫振蕩200 r/min，60 min。洗板4次，每孔加入100 μL血清及標準品，振蕩120 min。洗板4次，每孔加100 μL 二抗，振蕩60 min。洗板4次，每孔加100 μL 辣根過氧化物酶，振蕩30 min。洗板5次，每孔加100 μL底物，室溫避光孵育10～30 min。每孔加100 μL終止液，多功能酶標儀讀取波長在450 nm處吸光度，根據標準曲線計算IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4水平。

1.6 肝組織IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4 mRNA表達水平檢測 采用實時熒光定量PCR法。小鼠摘眼球放血后，留取肝組織。采用TRIzol法提取肝組織RNA，反轉錄合成cDNA。將獲得的cDNA按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書方法擴增目的基因。引物序列：GAPDH上游5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′，下游5′-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3′；IFN-γ上游5′-CACAGTCATTGAAAGCCTAGA-3′，下游5′-TTGCCAGTTC-CTCCAGATAT-3′；TNF-α上游5′-CTACTGAACTTCGGG-GTGAT-3′，下游5′-CAGGCTTGTCACTCG AATT-3′；IL-17A上游5′-TGAAGGCAGCAGCGATCA-3′，下游5′-GGAAGTCCTTGGCCTCAGTGT-3′；IL-4上游5′-GAAAA-CTCCATGCTTGAAGAA-3′，下游5′-TCTTTCAGTGATGTGGACTTG-3′。反應條件：95 ℃ 3 min預變性；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s，共40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，60～95 ℃緩慢升溫25 min產生融解曲線。以GAPDH作為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

2 結果

2.1 三組造模后不同時間點血清ALT水平比較 注射ConA后，模型組血清ALT水平6 h開始升高，18 h左右達峰值，48 h左右基本恢復。與對照慢病毒組相同時間點相比，miR-20b慢病毒組血清ALT水平降低(P均<0.05)；模型組與對照慢病毒組比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

2.2 三組肝組織病理情況 模型組和對照慢病毒組肝組織有一定面積的壞死區域，同時伴有炎癥細胞浸潤和肝實質細胞壞死；miR-20b慢病毒組僅有炎癥細胞浸潤，未見明顯壞死區域。

表1 三組造模后不同時間點血清ALT水平比較(U/L，x±s)

注：與對照慢病毒組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.3 三組血清IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4水平比較 與對照慢病毒組相比，miR-20b慢病毒組血清IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4水平降低(P均<0.05)；模型組與對照慢病毒組比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 三組血清IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4水平比較

注：與對照慢病毒組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.4 三組肝組織中IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4 mRNA表達比較 與對照慢病毒組相比，miR-20b慢病毒組肝組織中IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4 mRNA表達水平降低(P均<0.05)；模型組與對照慢病毒組比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表3。

表3 三組肝組織IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4 mRNA表達比較(x±s)

注：與對照慢病毒組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

肝臟是人體的一種特殊器官，以代謝功能為主，負責清除體內毒性產物、儲存糖原、合成蛋白等；同時也是重要的免疫器官，具有獨特的免疫微環境，富含大量免疫細胞，可識別外來毒素或病原微生物，通過免疫應答清除外來有害物質。肝臟是胸腺以外T細胞分化的重要場所，參與機體固有免疫應答和適應性免疫應答。自身免疫性肝炎以淋巴細胞、漿細胞浸潤為主要病理特征，其臨床表現包括高γ-球蛋白血癥、血清轉氨酶升高和自身抗體陽性等，其引起的急慢性肝損傷最終可導致肝纖維化、肝癌等高風險疾病。由于肝臟的免疫細胞間通過細胞因子、黏附分子及細胞間直接相互作用而形成一種獨特的網絡，因此深入研究肝臟的免疫調控機制尤為重要。研究表明，ConA、脂多糖、聚肌胞苷酸等均可誘導小鼠自身免疫性肝炎[3，9，10]。ConA所誘導的自身免疫性肝炎主要由NKT細胞、CD4+T細胞和Kupffer細胞介導[3，11，12]，同時大量細胞因子也參與到免疫應答之中，介導肝損傷的細胞因子主要包括IFN-γ、TNF-α、IL-4等；而IL-10、IL-15、IL-33等細胞因子起到負性調節作用[13]。

miRNAs參與多種病理及生理過程，可調控固有免疫應答和適應性免疫應答。miR-20b屬于miR-106a-363基因簇成員，位于人和小鼠的X染色體上[5]。研究顯示，miR-20b可能參與某些癌癥的發生發展過程，包括肝癌、乳腺癌和胃癌等[14,15]。我們的前期研究表明，在實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型中，miR-20b可能通過抑制靶基因RORγt和STAT3的表達，從而抑制Th17細胞的分化，可延緩實驗性自身免疫性腦脊髓炎的疾病進程[16]。但是目前有關miR-20b在自身免疫性肝炎中的作用機制尚不完全清楚。本研究結果顯示，ConA誘導小鼠自身免疫性肝炎后，血清ALT水平6 h開始升高，18 h左右達峰值，48 h左右基本恢復，表明自身免疫性肝炎模型建模成功。與注射對照慢病毒組小鼠相比，注射miR-20b慢病毒小鼠血清ALT水平顯著降低，表明miR-20b在抵抗ConA誘導的小鼠自身免疫性肝炎過程中發揮重要作用。

組織病理切片顯示，模型組和對照慢病毒組小鼠肝組織有一定面積的壞死區域，同時伴有炎癥細胞浸潤和肝實質細胞壞死；而注射miR-20b慢病毒組小鼠肝組織僅有炎癥細胞浸潤，并未見明顯壞死區域，組織病理切片與血清ALT水平變化基本一致。

ConA所誘導的自身免疫性肝炎過程中，介導肝損傷的炎癥因子主要包括IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-17A等[3]。本研究結果顯示，與注射對照慢病毒組小鼠相比，注射miR-20b慢病毒組小鼠血清及肝組織中炎癥因子IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4表達水平顯著降低，表明miR-20b對ConA誘導的自身免疫性肝炎進程中的炎癥反應具有一定的抑制作用。

綜上所述，miR-20b對自身免疫性肝炎小鼠的肝臟組織具有一定的保護作用，其機制可能是通過抑制炎癥反應從而降低肝損傷水平，其具體調控機制及相關靶基因有待進一步研究。