巨細(xì)胞病毒在平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的作用及調(diào)控機(jī)制

易立 曲媛 郭芳 湯劼 魏田力

100050北京,首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(易立、曲媛、郭芳),兒科(魏田力);100050北京,首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科(湯劼)

隨著社會老齡化的加速，心腦血管病已成為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，其最主要的病變基礎(chǔ)是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)涉及到AS病變發(fā)生、發(fā)展的全部過程。VSMC由收縮表型轉(zhuǎn)化為合成表型的過程稱之為表型轉(zhuǎn)化。VSMC表型轉(zhuǎn)化是易損斑塊、支架術(shù)后再狹窄和動脈粥樣硬化等血管性病變發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵性步驟[1]。

巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)屬于皰疹病毒科β亞科，是一種廣泛存在于自然界的機(jī)會致病性病毒。既往研究證實(shí)CMV所致的慢性潛伏性感染與動脈粥樣硬化的形成發(fā)展密切相關(guān)[2]。原發(fā)性CMV感染首先累及內(nèi)皮細(xì)胞，隨后在VSMC內(nèi)潛伏或持續(xù)性感染，導(dǎo)致VSMC的肥大、增殖和遷移，對AS的形成及狹窄起重要作用[3]，但CMV感染是否參與VSMC表型轉(zhuǎn)化的過程目前尚未明確。

PI3K/Akt信號通路是調(diào)節(jié)VSMC表型轉(zhuǎn)化的主要信號通路[4]，有文獻(xiàn)報道，其下游轉(zhuǎn)錄激活因子FoxO通過與促血管平滑肌細(xì)胞分化因子Myocardin的協(xié)同作用來調(diào)控表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志基因的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)以平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha，SM22α)和骨橋蛋白(osteopontin，OPN)分別作為VSMC收縮型和合成型的標(biāo)志基因，旨在通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)CMV是否參與VSMC的表型轉(zhuǎn)化過程，以及其可能的作用途徑和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 制備小鼠巨細(xì)胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV) 感染致動脈粥樣硬化的apoE-/-小鼠模型MCMV Smith株購自美國典型生物收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，通過空斑形成實(shí)驗(yàn)確定小鼠巨細(xì)胞的滴度為2×105PFU。8周齡雄性apoE-/-小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2014-0004，SPF級環(huán)境，高脂飼料喂食(購自北京科澳飼料有限公司，21%豬油，1.2%膽固醇，0.2%膽酸鈉)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。將動物隨機(jī)分為感染組和正常對照組，每組12只，感染組予2×105PFU MCMV 200μl腹腔注射，對照組予等量的DMEM腹腔注射。分別于實(shí)驗(yàn)第8、12、16周從兩組各隨機(jī)選取1只小鼠，通過超高分辨率小動物彩色多普勒超聲成像系統(tǒng)(MS-550高頻寬帶電子線陣探頭，頻率40 MHz)判斷小鼠主動脈粥樣硬化斑塊形成情況，決定取材時間。

1.2 apoE-/-小鼠主動脈取材、HE染色及免疫組化檢測 ApoE-/-小鼠禁食水8 h后稱重，取血。麻醉后取腹側(cè)正中線切口，暴露主動脈及其分支。切取主動脈起始至左鎖骨下動脈開口段，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5μm連續(xù)切片。Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件采集apoE-/-小鼠主動脈動脈粥樣硬化斑塊面積、管腔面積。每個指標(biāo)選取4個不同切面，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。免疫組化檢測各組小鼠主動脈斑塊中平滑肌表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志蛋白SM22a和OPN的表達(dá)。

1.3 小鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞(MOVAS)的培養(yǎng) MOVAS細(xì)胞購自美國ATCC，用含10%PBS的細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至70% ～80%，用0.25%胰酶和0.02%EDTA消化，按1∶4傳代，選取第3～5代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。MOVAS細(xì)胞分為兩組，實(shí)驗(yàn)組將MCMV與MOVAS共同孵育，對照組加入等量的DMEM，24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 小鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞(MOVAS)表型轉(zhuǎn)化相關(guān)指標(biāo)的檢測 應(yīng)用不同滴度MCMV刺激MOVAS細(xì)胞，MTT法檢測不同時間點(diǎn)各滴度MCMV對MOVAS細(xì)胞增殖的影響。選取MOVAS細(xì)胞增殖最明顯的MCMV滴度作為實(shí)驗(yàn)組，并以正常MOVAS細(xì)胞作為對照組。應(yīng)用Western blot檢測兩組細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白SM22a和OPN的表達(dá)。

1.5 MCMV對MOVAS表型轉(zhuǎn)化PI3K/Akt通路的作用 應(yīng)用Western blot分別檢測對照組和實(shí)驗(yàn)組PI3K/Akt通路中的Akt、磷酸化的Akt表達(dá)水平。給予特異性的PI3K通路的抑制劑Ly294002后，應(yīng)用Western blot檢測兩組平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白SM22a和OPN的表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 apoE-/-小鼠主動脈HE染色及免疫組化結(jié)果實(shí)驗(yàn)第16周，小動物超聲檢查顯示感染組主動脈壁內(nèi)膜增厚，連續(xù)性中斷，并可見動脈粥樣硬化斑塊形成，斑塊內(nèi)回聲略高于內(nèi)膜。對照組未見明顯斑塊形成。因此，本研究選擇飼養(yǎng)16周時進(jìn)行主動脈取材。apoE-/-小鼠主動脈HE染色觀察脂質(zhì)斑塊發(fā)現(xiàn)，對照組和感染組小鼠16周時動脈斑塊面積分別為(3.16±0.72)%和(28.71±3.07)%，感染組的動脈粥樣硬化斑塊的程度較正常飲食組嚴(yán)重(P=0.007，圖1)，且二者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 飼養(yǎng)16周時正常組和感染組apoE-/-小鼠主動脈HE染色(×40)Fig.1 HE staining of aorta in control and infection group of apoE-/-mice after 16 weeks of feeding(×40)

免疫組化染色結(jié)果顯示，對照組的10個主動脈中有9個SM22a染色陽性，SM22a陽性染色顆粒主要位于血管壁富含平滑肌細(xì)胞的中膜和外膜，而OPN染色陽性的主動脈則只有1個。CMV感染組的結(jié)果與對照組相反，10個主動脈中2個SM22a染色陽性，而OPN染色陽性的主動脈則多達(dá)10個，OPN陽性染色顆粒主要位于血管壁的中膜、外膜以及粥樣硬化斑塊中(圖2、3)。在未出現(xiàn)明顯動脈粥樣硬化斑塊的對照組中，動脈壁以表達(dá)收縮期蛋白為主；在MCMV感染組，動脈粥樣硬化程度加重，動脈壁中高表達(dá)的收縮期蛋白被合成期的蛋白所取代，說明MCMV感染促使動脈粥樣硬化進(jìn)展的同時，誘導(dǎo)了平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化。

2.2 MCMV感染對MOVAS表型轉(zhuǎn)化指標(biāo)的影響 觀察不同滴度及時間下MCMV對MOVAS細(xì)胞增殖能力的影響，發(fā)現(xiàn)在24 h誘導(dǎo)3×104PFU滴度的MCMV誘導(dǎo)細(xì)胞增殖最明顯(表1)。

圖2 正常組(×100)和感染組apoE-/-小鼠主動脈SM22a免疫組化染色(×40)Fig.2 SM22a immunohistochemical staining of aorta in normal group(×100)and infection group of apoE-/-mice(×40)

圖3 正常組和感染組apoE-/-小鼠主動脈OPN免疫組化染色(×100)Fig.3 OPN immunohistochemical staining of aorta in normal group and infection group of apoE-/-mice(×100)

表1 不同滴度MCMV誘導(dǎo)MOVAS細(xì)胞增殖情況Tab.1 The proliferation of MOVAScells induced by different titers of MCMV

Western blot結(jié)果顯示，3×104PFU MCMV感染MOVAS 24 h細(xì)胞后，SM22a表達(dá)較對照組下降，OPN表達(dá)較對照組增加，且兩組與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023，P=0.034，圖4、5)。

2.3 MCMV對MOVAS表型轉(zhuǎn)化PI3K/Akt通路的調(diào)控 為明確PI3K/Akt通路在MCMV促平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的作用，本研究檢測了磷酸化的Akt蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCMV明顯刺激磷酸化Akt蛋白表達(dá)上調(diào)(P=0.035)。本研究預(yù)先用PI3K的抑制劑Ly294002(10-6mol/L)孵育MOVAS 30 min后，用3×104PFU滴度的MCMV刺激24 h，LY294002可阻斷MCMV感染后的Akt蛋白磷酸化(P=0.031)，而對對照組無明顯影響(P=0.081，圖6)，提示MCMV促平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化可能經(jīng)由PI3K/Akt信號通路介導(dǎo)。

圖4 SM22a蛋白在對照組和實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)Fig.4 Expression of SM22a protein in the control group and the experimental group

圖5 OPN蛋白在對照組和實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)Fig.5 Expression of OPN protein in control group and experimental group

圖6 LY294002預(yù)處理前后，對照組和感染組磷酸化的Akt蛋白表達(dá)1 control group， 2 MCMV infection group， 3 control+LY294002，4 MCMV+LY294002 ?compared with the control group(P＜0.05)，?? compared with the MCMV group(P＜0.05)Fig.6 Expression of phosphorylated Akt protein in control group and infection group before and after LY294002 pretreatment

圖7 顯示單獨(dú) LY294002對MOVAS表型轉(zhuǎn)化收縮期標(biāo)志蛋白SM22a的表達(dá)無影響，但MCMV+LY294002組的SM22a蛋白表達(dá)較MCMV組明顯上調(diào)，且與對照組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)差異消失。說明LY294002可明顯抑制MCMV促平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的作用，進(jìn)一步提示PI3K/Akt信號途徑可能參與了MCMV促平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的過程。

圖7 LY294002預(yù)處理前后，對照組和感染組MOVAS細(xì)胞中SM22a蛋白的表達(dá)1 control group， 2 MCMV infection group， 3 control+LY294002，4 MCMV+LY294002 ?compared with the control group(P＜0.05)Fig.7 Expression of SM22a protein in MOVAS cells of control group and infection group before and after LY294002 pretreatment

3 討論

VSMCs的表型決定了細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能[5]。正常VSMCs是收縮型，VSMCs表型由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化是其增生的先決條件。生理情況下，VSMC處于非增殖狀態(tài)，表現(xiàn)為分化良好的收縮表型。血管損傷后，VSMC轉(zhuǎn)化為增殖性的合成表型，合成和分泌多種血管活性物質(zhì)；同時自身發(fā)生肥大，增殖和遷移，導(dǎo)致管壁增厚、管腔狹窄。SM22α是一個22×103的細(xì)胞骨架蛋白，其功能涉及血管平滑肌細(xì)胞的收縮調(diào)節(jié)，被認(rèn)為是收縮表型的標(biāo)志物之一。骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是細(xì)胞外基質(zhì)中一種富含唾液酸的磷酸化糖蛋白，最早從骨基質(zhì)分離，是合成型細(xì)胞的標(biāo)記基因，它的出現(xiàn)代表血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)入了合成型，具有了活躍的增殖與遷移能力。電鏡下，典型的收縮表型和合成表型的VSMCs應(yīng)具有明顯的形態(tài)、結(jié)構(gòu)區(qū)別。前者核小、染色質(zhì)致密，胞漿富含收縮蛋白、肌絲，而較少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體等合成、分泌性細(xì)胞器。而后者則核大、染色質(zhì)疏松，少肌絲，但卻富含合成、分泌性細(xì)胞器。

CMV感染首先累及內(nèi)皮細(xì)胞，隨后在VSMC內(nèi)潛伏或持續(xù)性感染，導(dǎo)致VSMC的肥大、增殖和遷移[6]。研究發(fā)現(xiàn)，在CMV所致的apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型中，收縮表型標(biāo)志蛋白SM22α較對照組表達(dá)明顯減少，而合成表型標(biāo)志蛋白OPN的表達(dá)則明顯增加。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相符，說明CMV感染可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。

VSMC表型轉(zhuǎn)化受多重因素的調(diào)控，PI3K/Akt信號通路是調(diào)節(jié)VSMC表型轉(zhuǎn)化的主要信號通路。在本實(shí)驗(yàn)中，PI3K/Akt信號通路的阻斷劑LY294002可以顯著阻斷MCMV感染誘導(dǎo)的SM22a蛋白表達(dá)的下調(diào)，以及Akt蛋白的磷酸化，而對照組無明顯變化。有文獻(xiàn)報道，PI3K/Akt信號通路的下游產(chǎn)物FoxO通過與促VSMC表型轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)錄激活因子Myocardin的協(xié)同作用來調(diào)控表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志基因的表達(dá)[7]。之前的研究發(fā)現(xiàn)CMV通過編碼miR-217下調(diào)FoxO3a蛋白的表達(dá)，使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移能力明顯增強(qiáng)[8]。近期的研究還發(fā)現(xiàn)，Myocardin的轉(zhuǎn)錄活性能被 CMV所增強(qiáng)，促使VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化[9]，這也為進(jìn)一步探討CMV誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制提供了思路。

總之，CMV感染可以促使平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，PI3K/Akt信號通路是其作用途徑，但其詳細(xì)的作用機(jī)制，目前還遠(yuǎn)未明確。

利益沖突 無