2017—2018年安徽省乙型流感病毒病原學特征分析

何蘭 何軍 俞俊嶺 龔磊 侯賽 朱夢 李衛東

230601合肥,安徽省疾病預防控制中心

近年來流感病毒對人類健康的危害已經越來越引起關注，因為隨著全球化趨勢的日益明顯，某一地區的季節性流感爆發常常會對全球人類的健康和社會的經濟產生非常大的影響[1-2]。乙型流感病毒每年都會在全世界范圍內流行，幾乎占了流感疾病負擔的1/3[3]，特別在兒童群體中能夠引起嚴重的疾病后果[4-5]，1940年在1起兒童急性呼吸道傳染病疫情中首次發現該病毒[6]。根據乙型流感病毒表面蛋白的抗原特性和血凝素基因的序列特征可將其分為Victoria和Yamagata兩大譜系，代表株分別為B/Victoria/2/87和 B/Yamagata/16/88。另據流行病學監測資料顯示自2000年起兩個系別的病毒可在同一個流感流行季中共同循環[7-8]，在其交互流行或共同流行過程中，極有可能發生系間重配[9]。2001—2011年間(2009年除外)，美國流感監測數據顯示乙型流感陽性樣本數約占流感陽性樣本總數的1% ～43.6%，平均為24%；而歐洲同期為1% ～59.8%，平均為 23%[10]。本文通過研究 2017—2018年度安徽省內流行的乙型流感病毒抗原性和基因特征，掌握該病原在安徽省的流行特征和分子進化特點，分析流行毒株與WHO推薦疫苗株成分是否匹配，為流感監測提供科學的防控依據。

1 材料與方法

1.1 流感監測數據 根據《全國流感監測技術指南》(2017年版)規定，一個流感監測年度的時間區間為每年的4月1日至次年的3月31日。從中國流感監測信息系統獲取2015—2016、2016—2017和2017—2018監測年度安徽省流感監測網絡實驗室核酸檢測結果，所有流感樣病例樣本來自國家流感哨點監測醫院，并用EXCEL軟件進行統計分析。

1.2 毒株來源 本研究的所有流感毒株均來自安徽省流感監測哨點醫院采集的咽拭子標本，分離病毒后送至安徽省流感參比中心，經復核鑒定為乙型流感后進行后續實驗，所有實驗操作和運輸保存均按照《國家流感監測方案(2017年版)》進行。

1.3 病毒抗原性分析 參考抗原采用WHO推薦的國際疫苗代表株，參考抗原和參考抗血清均由中國國家流感中心制備下發。根據《全國流感監測技術指南》(2017年版)的標準判定要求，當待檢病毒與參考雪貂抗血清的HAI效價低于參考病毒與參考抗血清自身HAI效價的8倍(含8倍)或以上時，

則認為待檢病毒是該參考抗血清檢測到的低反應株；反之，當相差8倍以內時(不含8倍)，則認為待檢病毒是參考病毒的類似株。

1.4 一步法RT-PCR擴增及產物純化 OneStep RT-PCR試劑盒(CatNo:210212)Qiagen公司生產，反應液配置組分:5倍RT-PCR Buffer為10μl；上游和下游20μmol/L的引物各為1μl；10 mmol/L dNTPMix為2μl；OneStep RT-PCR Enzyme Mix為2 μl；然后用無RNA酶水24μl補齊到40μl的體系總量，最后再加病毒核酸模板10μl。反應條件為:第一階段 42℃10 min、50℃30 min、95 ℃ 15 min，1個循環；第二階段94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72℃90 s，35個循環，；第三階段72℃10 min，1個循環。最后冷藏(4～8℃)保存。

1.5 全基因組序列測定 用瓊脂糖凝膠切割回收擴增的產物，M13為測序引物，用BigDyeTMTerminator v3.1 Cycle Sequencing kit(AppliedBiosystemsTM，批號:4337455)進行測序反應。測序反應后的產物使用BigDyeXTerminatorTMPurification Kit((AppliedBiosys temsTM，批號:4376486)進行純化，最后用基因測序儀(ABI 3730)開展測序分析(測序工作外包有資質的公司完成)。序列拼接和組裝由DNAMAN(ver sion 6)軟件完成。

1.6 序列分析 使用Mega6.0軟件中的Clustal W法做序列比對分析，Neighbor-joining法做遺傳進化分析，再分析HA和NA蛋白的關鍵氨基酸位點和變異位點。HA和NA進化分析參考株參照方斌等[11]研究方法，選用歐洲疾病預防控制中心2017—2018年流感季的概況報告(https://ecdc.europa.eu)，Yamagata系 1～3分支參考株各是:B/Wisconsin/1/2010 及 B/Brisbane/3/2007、B/Florida/4/2006；Victoria系1B與1 A分支參考株是B/Hong Kong/514/2009及 B/Brisbane/60/2008。

2 結果

2.1 2015—2018年安徽省乙型流感流行情況 由圖1所示，安徽省乙型流感每年均有流行高峰，2015年7～8月份、2016年2月份、2016年11～12月份、2017年2月份、2017年8～9月份和2018年2月份均為甲型流感流行高峰月份；2015—2018年安徽省乙型流感Victoria和Yamagata兩大譜系呈交替流行，2015年1～3月份以Yamagata系為主，2016年2～5月份以Victoria系為主，而2017年2～5月份流行Victoria系，9月份以后Yamagata系流行占據主導優勢。由圖2所示，2015—2016流感監測年度，WHO推薦B/Phuket/3073/2013(Yamagata系)為疫苗候選株，2015年12月份以后安徽省Yamagata系占全部乙型流感流行比例明顯下降；2016—2017年度B/Brisbane/60/2008(Victoria系)為疫苗候選株，該監測年度安徽省仍以Victoria系乙型流感病毒為主要流行株；2017—2018年度疫苗候選株仍為Victoria系，安徽省Victoria系乙型流感自2017年7月份以后開始下降，同期Yamagata系占比呈明顯上升態勢。

圖1 2015—2018年安徽省乙型流感病毒流行月分布Fig.1 Monthly distribution of influenza B virus in Anhui province from 2015 to 2018

圖2 2015—2018年安徽省乙型流感病毒流行月占比Note:Vaccine strains agains influenza B virus recommended by the WHO for trivalent vaccines in the Northern HemisphereFig.2 Lineage-specific statistics for influenza B viruses in Anhui province from 2015 to2018

2.2 2017—2018流感監測年度安徽省乙型流感抗原性分析 從2017—2018流感監測年度內安徽省轄區內網絡實驗室送檢至省級流感參比中心的乙型流感毒株中，隨機選取了99株毒株進行抗原性分析，其中Yamagata系90株，Victoria系9株。WHO推薦該年度的三價疫苗組分中乙型Victoria系毒株為B/Brisbane/60/2 008類似株，四價疫苗組分包含了Yamagata系的 B/Phuket/3073/2013類似株[12]，國家流感中心以B/Brisbane/60/2008和B/Phuket/3073/2 013分別免疫雪貂制備了參考抗血清，對上述挑選的99株乙型流感毒株進行抗原性分析。Victoria系毒株抗原性分析結果顯示:9株毒株全部為B/Brisbane/60/2008的類似株，無低反應株；Yamagata系毒株抗原性分析結果顯示:90株毒株中有84株(93.3%)為 B/Phuket/3073/2013的類似株，6株(6.7%)為低反應株。

2.3 2017—2018安徽省乙型流感基因特征分析隨機選取本年度乙型流感毒株31株進行HA和NA基因測序并構建進化樹(圖3)，進化分析顯示:22株Yamagata系乙型流感病毒HA基因均屬于Yamagata Clade 3分支，其中 20株與 B/Phuket/3073/2013疫苗株屬于共同的亞支，而 B/Anhui-Yingzhou/11238/2017和B/Anhui-Yingzhou/11264/2017兩株病毒HA基因屬于另一亞支，還有一個亞支為B/Wisconsin/01/2010類似株；9株Victoria系乙型流感病毒HA基因均屬于Victoria Clade1A分支，其中以 B/Hong Kong/286/2017和 B/Norway/2409/2017為代表的最新進化亞支 Clade1A(Δ1、Δ2)中未發現安徽省流行株。

根據上述31株乙型流感毒株NA基因進化分析發現，B/Anhui-Yingzhou/11238/2017和 B/Anhui-Yingzhou/11264/2 017兩株Yamagata系病毒的NA基因屬于Victoria系，與疫苗株B/Malaysia/2506/2004的NA基因親緣關系較近，因此這兩株Yamagata系病毒為BY-HA/BV-NA系間重配病毒。

所有22株Yamagata系乙型流感病毒HA基因和B/Phuket/3073/2013疫苗株相比，均有D196 N突變，除B/Anhui-Yingzhou/11238/2017和B/Anhui-Yingzhou/11264/2 017兩株病毒以外，其他20株病毒HA基因均攜帶 L172Q和 M251V突變；9株Victoria系乙型流感病毒HA基因與B/Brisbane/60/2008疫苗株對比，均有I117V和N129D突變。根據NA基因序列對神經氨酸酶活性位點進行分析，安徽省流行的乙型流感病毒未發現對神經氨酸酶敏感性降低的分子突變。

3 討論

乙型流感病毒兩個譜系在某個區域的交叉循環流行幾乎是不可預測的，從而導致WHO目前推薦的三價流感疫苗和當地流行的乙型流感譜系不匹配也常有發生[13]。2015—2016年度安徽省主要以Victoria系乙型流感病毒為主要流行株，而Yamagata系為疫苗候選株；2016—2017、2017—2018年度均以Victoria系為疫苗株，但2017年7月份以后，安徽省Yamagata系乙型流感呈明顯的優勢流行。因此近3年期間WHO推薦的三價疫苗株與安徽省流行的乙型流感病毒時常不匹配，但通過抗原性分析發現，2017—2018年度安徽省流行的乙型流感病毒均為WHO推薦疫苗株的類似株。由此可見，除了三價流感疫苗未完全覆蓋安徽省所有流感型別外，疫苗接種率低也有可能是造成該年度Yamagata系乙型流感優勢流行的重要原因之一。

盡管該年度安徽省流行的乙型流感病毒的HA基因均處于Yamagata系clade 3和Victoria系clade 1 A分支中，但均在分支出現了亞支，可能與宿主適應性選擇相關，但安徽省Victoria系流感病毒未呈現“階梯樣”進化特征和Yamagata系復雜的拓撲結構[14]，可能是因為選取的樣本時間跨度較短有關。值得關注的是，本研究首次發現安徽省存在BYHA/BV-NA系間重配病毒，且基因重配在乙型流感病毒的流行、進化過程中發揮著重要的作用[15]。方斌等[11]研究發現，乙型流感發生系內重配和系間重配的病毒均會造成該病毒的大流行，可能因為基因的重配將導致其發生抗原轉變。由于人群廣泛缺乏相應的免疫保護屏障，因而會引發乙型流感的暴發或流行[16]。安徽省發現的Yamagata系間重配病毒為2017年12月份分離，此時正值該系病毒流行峰值。盡管乙型流感病毒的點突變速率小于甲型流感病毒，但由于頻繁地發生系內或系間重配，為病毒逃逸宿主既存的獲得性免疫應答創造有利條件，使其可以長期在人群中流行[17]，因此應密切關注該病毒的分子變異。

將WHO推薦的2017—2018年度疫苗株 B/Brisbane/60/2008和 B/Phuket/3073/2013，與該年度安徽省乙型流感病毒分別比對它們的氨基酸序列，在重要的HA抗原表位190-helix(194～202)、160-loop(162～167)及150-loop(141～150)與120-loop(116～137)之中，有22株Yamagata系病毒的D196 N突變發生在190-helix抗原表位，該位點具有很強的抗原性[18]；9株Victoria系病毒的I117 V和N129D突變發生在120-loop抗原表位，該表位是突變最為頻繁的區域，而129位點的突變可引起抗原變化[11，19]。

本文通過對安徽省2017—2018年度乙型流感病毒流行病學和基因特征進行分析，初步掌握了該病原在安徽省的基本情況，但仍需進一步分析該病原在人和動物間的流行近況，以及病毒進化特征和致病機理，從而制定合理的疫苗免疫接種策略進行科學防控。

利益沖突 無