薄皮甜瓜‘花雷’再生體系的建立

武云鵬 ，張若緯 ，彭冬秀 ，張秀婷

（1.天津市蔬菜遺傳育種企業重點實驗室·蔬菜種質創新國家重點實驗室·天津科潤農業科技股份有限公司蔬菜研究所 天津 300381； 2.天津生物工程職業技術學院 天津 300462）

甜瓜（Cucumis meloL.）是葫蘆科黃瓜屬一年生蔓生植物，其香氣怡人，肉質酥脆多汁，并富含維生素、蛋白質等，深受消費者喜愛。隨著人們生活水平的提高，對高品質甜瓜的需求逐年增加。但是，常規育種周期長，易受環境因素影響，制約了育種進程。近年來，隨著基因工程等先進的技術在育種工作中的應用，將目的基因導入甜瓜，加快甜瓜種質資源的創新，改善甜瓜品質，已成為甜瓜育種的新途徑?；蚬こ痰燃夹g的應用，需建立高效的再生體系。筆者以甜瓜子葉、胚軸、真葉為外植體，總結出適合甜瓜離體培養的激素種類、濃度，并制定一套完整的甜瓜高效離體再生體系，為甜瓜基因工程提供技術保障。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2016—2018年在天津科潤農業科技股份有限公司蔬菜研究所實驗室進行，‘花雷’甜瓜種子由天津科潤蔬菜研究所提，IAA、6-BA、IBA由Solarbio提供，分析軟件為SPSS。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗的獲得 將甜瓜種子放入無菌水中浸泡4 h后剝去種殼，無菌條件下放入75%（φ）酒精中浸泡30 s，無菌蒸餾水沖洗4～5次，再次浸泡在2%NaClO溶液15 min，無菌蒸餾水沖洗4～5次，用無菌濾紙吸干水分后，然后接種于MS培養基上（蔗糖30 g·L-1，瓊脂 7 g·L-1，pH 值 5.8），置于恒溫 26 ℃、光強1 600 lx、光照16 h、黑暗8 h的環境中生長。

1.2.2 愈傷組織和不定芽誘導 將7 d苗齡的無菌苗子葉在無菌條件下切成5 mm×5 mm小塊，胚軸切成5 mm小段，15 d苗齡的真葉切成5 mm×5 mm小塊，分別接種于表2的9組培養基中，每種外植體接種10瓶，每瓶4個外植體。30 d后統計外植體出愈率和出芽率。

1.2.3 不定芽分化 切取1.2.2獲得的綠色、疏松不定芽接種于16組分化培養基中，每個不定芽接種10瓶，每瓶4個不定芽。30 d后統計不定芽分化頻率。

1.2.4 生根培養 叢生芽生長至1.5～2 cm時，從基部切下，轉至生根培養基中生根培養。

2 結果與分析

2.1 最佳外植體確定

由表1可知，子葉、胚軸、真葉均可誘導出愈傷組織，子葉、胚軸誘導率 100%，真葉誘導率僅為40%。其中，子葉在接種5 d后明顯膨大至原來3倍左右（圖1），同時發生卷曲，葉脈處顏色變淡，接種30 d后愈傷組織大量緊密，有許多綠色凸起；胚軸接種10 d后兩端變鈍，顏色逐漸變淺，接種30 d后形成疏松淡黃色愈傷組織；真葉接種后膨大緩慢并且顏色變淺，接種30 d后呈現淡黃色愈傷組織，繼續培養10 d后，愈傷組織褐化。說明子葉在這3種外植體中誘導愈傷組織速度快，長出的愈傷組織緊密、綠色，最適合組織離體培養。

表1 不同外植體出愈情況

圖1 子葉接種誘導培養基5 d

2.2 誘導子葉的最佳培養基

將子葉接種于誘導培養基中，由表2可知，當IAA 濃度較低時（1、2、3號培養基），隨著 6-BA 濃度的增加，愈傷組織的質量逐漸下降；當6-BA濃度較低時（1、4、7號培養基），隨著IAA濃度的增加，愈傷組織結構發生改變，由緊密變為疏松，顏色變化較大，當 IAA 質量濃度較高時（2.0 mg·L-1），愈傷組織已經發生褐化。由此可見，當子葉接種于低濃度6-BA、IAA的誘導培養基中時（1號培養基），其愈傷組織發生最快且組織結構緊密，顏色為綠色，并有許多凸起。

表2 子葉在9種愈傷組織和不定芽誘導培養基中的生長情況

子葉在誘導培養基上培養約10 d后，其表面產生許多小突起，20 d后小突起形成叢生芽（圖2），30 d后統計愈傷組織表面叢生芽的數量，結果如表2所示。對誘導的平均芽數進行單因素方差分析，結果表明，由于培養基中生長調節劑不同造成分生芽數量差異顯著。這說明生長調節劑種類和濃度差異是影響不定芽分化的關鍵因素。從出芽率和平均每塊愈傷的出芽數等因素綜合考慮，選擇MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IAA 為誘導子葉愈傷組織和不定芽的最佳培養基。

圖2 子葉誘導產生不定芽

2.3 不定芽分化的最佳培養基

切取愈傷組織上的不定芽，接種在分化培養基中（表3）10 d后，不定芽開始分化，30 d后統計不定芽分化數量（圖3）。當6-BA濃度一定時，隨著IBA濃度的增加，部分不定芽產生不定根；而當IBA濃度很小時，隨著6-BA濃度的增加，不定芽停止分化，但玻璃化隨之加重，當6-BA質量濃度為2.0 mg·L-1時，不定芽褐化。利用SPSS軟件進行單因素方差分析，由于生長調節劑濃度不同，導致不定芽分化數量差異顯著。因此，綜合出芽率等因素考慮，MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA 為芽分化最佳培養基，這與趙燕[1]等人的研究成果相一致。

表3 16組分化培養基對不定芽分化的影響

圖3 不定芽分化

2.4 生根培養

由表4可知，當MS培養基中不添加任何激素時，在不定芽莖基部產生少量愈傷組織，因此，添加一定量的IBA有利于根的發生。隨著IBA濃度的增高，不定根數量隨之增多，當IBA濃度為0.2 mg·L-1時，最有利于根的生長（圖4）。

表4 不同濃度生根培養基對生根影響

圖4 不定芽生根

3 討論

3.1 外植體的選擇

筆者對薄皮甜瓜‘花雷’的子葉、胚軸、真葉進行了愈傷組織誘導對比，在接種30 d后3種外植體均能誘導出愈傷組織，子葉出愈速度快，組織緊密、綠色，有許多凸起；胚軸出愈速度慢，組織疏松、淺黃色；而真葉出愈速度最慢，且褐化嚴重。因此子葉被作為誘導甜瓜不定芽發生的首選外植體[2]，這與喬永旭[3]、魏曉明等[4]的研究結果一致。

3.2 植物生長調節劑的影響

培養基中細胞分裂素和生長素的配比是影響甜瓜子葉再生頻率的關鍵因素之一，在不同濃度組合的6-BA與IAA的誘導培養基上，子葉的再生頻率和平均再生芽數差異很大，本試驗結果表明，適合甜瓜子葉誘導愈傷組織的最佳培養基為MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IAA，這與付秋實等[5]的試驗結果不相符，有可能是由于不同甜瓜品種內源生長調節劑含量不同導致的結果不一致。在不定芽分化過程中，當6-BA濃度很低時，隨著6-BA濃度的增加，不定芽分化率變化較大，反之變化較小，所以正如前人研究所述，6-BA對甜瓜不定芽的分化起決定性作用[1]。在生根培養過程中，培養基添加了IBA，因為IBA主要用于促進扦插生根，其引起的不定根多而細長。試驗證明，生根培養基以培養基MS+0.2 mg·L-1IBA為最佳組合。張慧君等[6]在生根培養時選擇不添加任何激素的MS培養基，生根率 100%；施先鋒等[7]認為，在 1/2MS+0.1 mg·L-1IAA的培養基中最易生根，盛慧等[8]認為，生根培養基最佳組合為1/2MS+NAA 0.5 mg·L-1。由于試驗條件所限，未能對生根培養基進行更深一步研究，因此，在今后試驗過程中，嘗試不同生根培養基，以求更高效地培養出再生苗。