超高效液相色譜-串聯質譜法測定楊梅中嘧菌酯殘留

王全勝，付巖，張亮，朱勇，趙健，吳銀良

(寧波市農業科學研究院，浙江 寧波 315040)

嘧菌酯(Azoxystrobin)是新型高效、廣譜、內吸性殺菌劑，對幾乎所有真菌綱(子囊菌綱、擔子菌綱、卵菌綱和半知菌類)病害，如白粉病、銹病、霜霉病、稻瘟病等均有良好的活性，其能夠與細菌細胞內線粒體上細胞色素相結合，阻斷細胞色譜b和細胞色素c1之間的電子傳遞，抑制能量合成，進而使細菌死亡[1]。目前，嘧菌酯在我國已登記用于水稻、黃瓜、馬鈴薯、葡萄、番茄等作物[2]，使用較廣。

楊梅屬于楊梅科楊梅屬，于我國浙江、江西、云南、福建等地均有種植。楊梅果樹病蟲害較多，白腐病等細菌病害時有發生，嚴重影響其品質和產量[3]。而嘧菌酯因其廣譜高效等優點可被用于楊梅上防治褐斑病等病害。因此，有必要對其使用后可能產生的殘留風險進行評估，而快速高效的殘留分析方法則不可或缺。本文擬基于QuEChERS方法，結合超高效液相色譜-串聯質譜 (UPLC-MS/MS)，建立一種用于檢測楊梅中嘧菌酯殘留量的分析方法，以期為有效監控楊梅中嘧菌酯殘留風險提供一定的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試楊梅品種為東魁楊梅。

試驗儀器由Waters Xevo TQ MS超高相液相色譜-串聯質譜儀配Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美國Waters公司)；KS4000ic恒溫振蕩器(德國IKA公司)；3K15高速離心機(德國Sigma公司)；GENIUS3旋渦混合器(德國IKA公司)；萬分之一電子天平(瑞士Mettler Toledo 公司)；Milli-Q超純水儀(美國millipore公司)。試劑有乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Tedia公司)；PSA(40～60 μm，上海安譜公司)；無水硫酸鎂及氯化鈉(分析純，中國國藥集團)；嘧菌酯標準品(100 μg·mL-1，農業部環境保護科研監測所)。

1.2 樣品前處理

1.2.1 提取

稱取樣品5 g(精確至0.01 g)置于50 mL離心管中，加入20.0 mL乙腈，以350 r·min-1振蕩提取30 min后，加入5 g氯化鈉劇烈震蕩1 min，再以9 500 r·min-1離心1 min，待凈化。

1.2.2 凈化

取2 mL上清液于10 mL離心管中，加入100 mg PSA和300 mg無水硫酸鎂，漩渦1 min，9 500 r·min-1離心1 min。吸取凈化上清液1.00 mL至另一試管中并加入1.00 mL 0.1%甲酸溶液混合均勻，過0.22 μm濾膜后供UPLC-MS/MS測定。

1.3 儀器條件

流動相為0.1%甲酸溶液(A)和乙腈(B)，采用梯度淋洗(表1)，色譜柱柱溫為35 ℃，進樣體積10.0 μL。

離子源為電噴霧離子源，正離子掃描，采用多重反應監測模式(表2)，毛細管電壓為2.50 kV，霧化氣流速1 000 L·h-1，錐孔氣流速50 L·h-1，離子源溫度為150 ℃，霧化溫度為500 ℃。

表1 流動相梯度洗脫條件

表2 多重反應監測

注：*為定量離子。

2 結果與分析

2.1 儀器條件的優化

首先對質譜條件進行優化。研究表明，嘧菌酯能在ESI+離子模式下產生豐富的離子碎片，并有較高的響應值。通過利用儀器自帶的Intellistart軟件，確定嘧菌酯的定性定量離子對及其對應的最優碰撞電壓、錐孔電壓等條件。此外，為進一步優化質譜條件，將嘧菌酯標準液在全掃描模式下分別優化毛細管電壓、錐孔氣流速、脫溶劑氣流速等參數，最終確定嘧菌酯的質譜條件。同時，為有效分離目標物和雜質，提高嘧菌酯的靈敏度，還對液相條件進行了優化。結果表明，當流動相分別為乙腈-水、乙腈-乙酸銨溶液、乙腈-甲酸溶液時，乙腈-甲酸溶液體系下的嘧菌酯響應最高，這可能是由于甲酸提高了嘧菌酯的質子化效率[4]，進而提高了其靈敏度。與甲醇相比，選擇乙腈為流動相時，相同梯度洗脫條件下出峰時間更快，能夠縮短樣品分析時間。因此，最終確定流動相為0.1%甲酸溶液-乙腈梯度洗脫，此條件下嘧菌酯響應高，峰型好，保留時間適中。

2.2 標準曲線

準確稱取嘧菌酯標準品0.01 g于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成質量濃度為100 mg·L-1的標準母液。將100 mg·L-1的嘧菌酯標準母液用定容溶劑(楊梅空白基質提取液∶0.1%甲酸溶液1∶1)稀釋配制成10.0 mg·L-1作為基質標準母液，再用定容溶劑將其梯度稀釋成0.50、0.10、0.050、0.010、0.005、0.001 mg·L-1不同濃度的標準基質工作液，按1.3節儀器條件進行測定。以進樣濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線(圖1)。結果表明，嘧菌酯在0.001～0.50 mg·L-1濃度線性關系良好，標準曲線方程為y=5 523 549x-15 069，相關系數r為0.999 8。

圖1 楊梅基質中嘧菌酯標準曲線

2.3 方法的靈敏度、準確度和精密度

以3倍信噪比計算得出儀器的檢出限為5.5×10-14g，靈敏度較高。為確定方法的準確度和精密度，取楊梅空白樣品進行回收率試驗，添加水平分別為0.005、0.1、1.0 mg·kg-1，每處理重復5次，按1.2節前處理步驟進行處理，基質匹配外標法定量。結果顯示，嘧菌酯在楊梅中添加回收率為82%～105%，相對標準偏差為1.5%～10.2%。說明該方法準確度和精密度均較好，符合農藥殘留分析的要求[5]。

表3 嘧菌酯在楊梅中的添加回收率

3 小結與討論

目前，關于嘧菌酯殘留分析方法的研究報道相對較少，其分析方法主要集中在氣相色譜檢測[6-10]，且前處理較為復雜。如李瑞娟等[11]使用QuEChERS法進行前處理，采用氣相色譜-電子捕獲檢測器對小麥中嘧菌酯殘留量進行檢測，其最小檢出量為5×10-12g，最低檢測濃度為0.01 mg·kg-1；曹俊麗等[12]利用氣相色譜-質譜串聯儀對稻田中的嘧菌酯進行了檢測，方法檢出限為0.01 mg·kg-1左右，定量限為0.05 mg·kg-1；范麗麗等[13]建立了鐵皮石斛、浙貝母和人參中嘧菌酯的殘留分析方法，采用乙腈提取、二氯甲烷液液萃取、柱層析凈化、氣相色譜-電子捕獲檢測器檢測，方法的檢出限為0.002～0.004 mg·kg-1，定量限為0.01 mg·kg-1。上述整個分析過程耗時相對較長，不利于大批量樣品的分析測定和殘留風險監控。本文所建立的方法基于QuEChERS法，并進行了簡化，同時結合UPLC-MSMS檢測，大大縮短了樣品分析時間，且靈敏度、準確度亦均符合農藥殘留分析的要求。總之，本研究通過對儀器條件和前處理方法的優化，建立了楊梅中嘧菌酯殘留的殘留分析方法，可為有效監控楊梅中嘧菌酯的殘留風險提供技術支撐。