棘胸蛙檸檬酸桿菌的分子鑒定及防治技術

胡靄臻，俞艷，周超，王小航，鄭善堅

(浙江師范大學野生動物保護與利用技術中心 野生動物生物技術與保護利用浙江省重點實驗室，浙江 金華 321004)

棘胸蛙(Quasipaaspinose)，又稱石蛙或石雞，屬于兩棲綱、無尾目、蛙科，是我國獨有的野生大型蛙類[1]。棘胸蛙肉質細膩香滑，富含18種氨基酸，食用價值和藥用價值高，被譽為“百蛙之王”[2-13]。隨著野生棘胸蛙的過度捕撈和生存環境急劇惡化，野生棘胸蛙數量明顯下降，2012年被列入“世界自然保護聯盟”(IUCN)瀕危物種紅色名錄，屬易危物種。本研究通過對患病蛙和健康蛙的對照實驗，以期為棘胸蛙檸檬酸桿菌的分離鑒定及防治提供建議。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蛙

患病棘胸蛙采自金華某棘胸蛙養殖基地，平均體重(120±8.5)g；健康棘胸蛙均購自金華李駿棘胸蛙養殖基地，平均體重(50±4.3)g。

1.1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；PCR引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Taq酶、PCR Master Mix和DL 2000 DNA Marker均購自克勞寧(北京)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離

在無菌操作臺內取患病棘胸蛙的頭部、腿部和肝組織，接種于普通瓊脂培養基上，32 ℃培養24 h，觀察病原菌的生長情況及菌落特征。選取長勢良好的單一菌落進行純培養，分別命名為LJ10201、LJ10202、LJ10203。革蘭氏染色觀察病原菌的形態、結構和特征。

1.2.2 人工感染試驗

取純化后的菌株分別接種于LB液體培養基，培養24 h后5 000 r·min-1離心1 min，用無菌PBS離心洗滌2次，調整菌懸液濃度至1×107mL-1。取健康棘胸蛙48只，隨機分成4組，每組12只。采用腹腔注射法，分別注射0.1 mL LJ10201、LJ10202、LJ10203菌株的菌懸液，對照組腹腔注射0.1 mL無菌PBS。定期換水，保持水質清新，于實驗室人工飼養10 d，每天觀察并記錄組棘胸蛙的患病與死亡情況。

1.2.3 生理生化特性鑒定

使用梅里埃VITEK 2 Compact 全自動細菌鑒定儀鑒定生理生化指標。

1.2.4 16S rDNA基因序列分析及系統發育樹構建

用DNA提取試劑盒分別提取純培養的LJ10201、LJ10202、LJ10203病原菌DNA。上游引物為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′， 下游引物為5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。25 μL PCR反應體系為ddH2O 9.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板1.0 μL，10×buffer、dNTP及Taq酶混合溶液12.5 μL。采用的PCR反應條件為94 ℃預變性4 min；94 ℃ 1 min，49～54 ℃(12個溫度梯度)1 min，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min，所得產物電泳后觀察。PCR產物進行測序，并對分離得到的3株病原菌16S rDNA序列進行系統發育學分析。

1.2.5 藥敏特性分析

病原菌于恒溫培養箱培養24 h后，挑取長勢良好的單菌落接種在LB液體培養基上，通過平板計數法和McFarland比濁法調整菌懸液濃度至1×107mL-1。用無菌移液管量取100 μL菌懸液于普通瓊脂培養基，涂布均勻。采用標準紙片瓊脂擴散法檢測，觀察并記錄各組抑菌圈的大小，根據抑菌圈大小判斷其藥物敏感性。

2 結果與分析

2.1 病原菌觀察

從患病棘胸蛙頭部、腿部和肝部分離得到的病原菌LJ10201、LJ10202、LJ10203菌株在普通瓊脂培養基上的菌落形態均為：乳白色，不透明或半透明，凸起，邊緣光滑整齊，恒溫培養24 h后菌落直徑為1.0～3.0 mm。挑取單菌落，革蘭氏染色，置于普通光學顯微鏡下鏡檢，發現3株病原菌均為革蘭氏陰性菌，呈桿狀或短桿狀，無芽孢，無莢膜。

2.2 人工感染實驗

用分離得到的病原菌感染健康的棘胸蛙72 h后，棘胸蛙出現發病癥狀，癥狀表現為：頭部出現白斑，從吻部開始表皮潰爛至向全身蔓延并逐漸脫落，肌肉露出，攝食活動減弱，腹部腫大，運動減弱，個體表現呆滯。感染96 h后，棘胸蛙出現死亡現象。感染8 d后，3個試驗組的棘胸蛙全部死亡，對照組生長狀況良好。解剖病死蛙發現，其腹部有不同程度的積水，內臟呈點狀出血，胃及腸道內無食物或少有食物，并伴有腸道輕度糜爛等癥狀，與原發病棘胸蛙表現癥狀相同且病理變化相似。在病死蛙的肝、腎等處分離得到與LJ10201、LJ10202、LJ10203菌株菌落形態相似、生理生化特征一致的菌株，說明本試驗中分離得到的3株LJ10201、LJ10202、LJ10203菌株為致病菌株。

2.3 生理生化特征鑒定

根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》，運用微生物全自動分析儀對3株病原菌進行生理生化檢測菌株檢測結果見表1。結果表明，LJ10201、LJ10203菌株各項生理生化檢測結果與弗氏檸檬酸桿菌相符合，初步判定其為弗氏檸檬酸桿菌；LJ10202菌株各項生理生化指標與布氏檸檬酸桿菌相符合，初步將其判定為布氏檸檬酸桿菌。

表1 菌株生理生化特征

注：+，陽性；-，表示陰性；(-)，弱陰性。

2.4 16S rDNA基因序列分析及系統發育樹構建

分別以LJ10201、LJ10202、LJ10203菌株DNA為模板進行16S rDNA擴增，電泳檢測擴增產物，長度約為1 500 bp(圖1)。送檢測序后，與Gene bank中的序列進行對比，發現LJ10201和LJ10203菌株的16S rDNA基因序列與弗氏檸檬酸桿菌標準株(KF535108.1、KF145194.1)的同源性高達99%， LJ10202菌株的16S rDNA基因序列與布氏檸檬酸桿菌標準菌株(KC139411.1)的同源性高達99%。

圖1 LJ10201、LJ10202、LJ10203菌株 16S rDNA電泳結果

選取弗氏檸檬酸桿菌、布氏檸檬酸桿菌和腸桿菌科不同屬的菌種部分16S rDNA序列構建系統發育樹(圖2)。

2.5 藥敏特性

研究發現，從患病棘胸蛙頭部分離得到的LJ10201菌株對強力霉素、新霉素、頭孢他啶、氯霉素、頭孢拉定(先鋒Ⅵ)、鏈霉素、恩諾沙星、阿莫西林、慶大霉素敏感，對阿奇霉素、羅紅霉素中度敏感，對復方新諾明、紅霉素、克拉霉素、萬古霉素、利福平、青霉素、卡那霉素不敏感。從病蛙腿部分離得到的LJ10202菌株對頭孢拉定(先鋒Ⅵ)、氯霉素敏感，對新霉素、克拉霉素、萬古霉素、羅紅霉素中度敏感，對復方新諾明、紅霉素、阿莫西林、阿奇霉素、強力霉素、利福平、青霉素、頭孢他啶、鏈霉素、恩諾沙星、卡那霉素、慶大霉素不敏感。從病蛙肝部分離得到的LJ10203菌株對強力霉素、頭孢他啶、阿奇霉素、鏈霉素、恩諾沙星、新霉素、卡那霉素、慶大霉素敏感，對克拉霉素中度敏感，對復方新諾明、紅霉素、頭孢拉定(先鋒Ⅵ)、阿莫西林、萬古霉素、利福平、青霉素、羅紅霉素、氯霉素不敏感(表2)。

圖2 LJ10201、LJ10202、LJ10203菌株系統發育樹

表2 LJ10201、LJ10202、LJ10203菌株藥敏試驗結果

注：S，敏感；I，中度敏感；R，不敏感。

本實驗中，各菌株的藥物敏感性與已報道的弗氏檸檬酸桿菌的耐藥性有一定差異，各菌株之間的藥物敏感性也存在差異，這可能與分離方法或菌株來源不同有關。研究發現，檸檬酸桿菌對紅霉素、青霉素、利福平等常用藥物已產生耐藥性，但由于個體生活環境等的差異，不同來源的菌株之間耐藥性仍有差異。因此，在水產養殖過程中，要針對病原菌合理用藥，外用兼內服抗生素藥物，結合多維補充，提高機體免疫力，加快創口愈合，才能達到良好的治療效果，并減緩檸檬酸桿菌耐藥性的形成。

3 討論

通過無菌操作分離得到棘胸蛙爛皮病的病原菌，經細菌形態、生理生化鑒定、16S rDNA基因序列同源性分析和人工感染試驗，證實病原菌LJ10201、LJ10203為弗氏檸檬酸桿菌， LJ10202為布氏檸檬酸桿菌。弗氏檸檬酸桿菌和布氏檸檬酸桿菌廣泛分布于土壤、水體和動物體內，可引起人獸共患疾病。EWERS等[14]發現狗、貓和馬可感染弗氏檸檬酸桿菌，引起炎癥、敗血癥甚至急性死亡，劉廣義等[15]從患者體內分離得到了156株弗氏檸檬酸桿菌，YANAGAWA等[16]、MINJEONG等[17]分別從臨床感染的患者體內分離得到病原菌檸檬酸桿菌。

近年來，有關檸檬酸桿菌感染水生動物的報道日漸增多。王家禎等[8]發現青魚感染弗氏檸檬酸桿菌后出現體表發黑、粘液增多、肛門紅腫、腹部有出血點等癥狀，解剖發現其腹腔積水，肝、脾腫大，腸道發炎并出血，從病魚肝臟中可分離得到弗氏檸檬酸桿菌。肖寧等[18]從瀕死的克氏原螯蝦肝胰腺中分離得到弗氏檸檬酸桿菌，曹正嬌[12]和高正勇等[19]從患病的大鯢中分離得到了弗氏檸檬酸桿菌。水生動物易感染檸檬酸桿菌可能與水生動物生存環境有關，水體中的檸檬酸桿菌可由水生動物傷口或經口攝食而大量進入體內，引發疾病，且在水中細菌性疾病蔓延速度極快，往往引起個體大量死亡[20]。因此，在水產養殖中，養殖人員要做好預防措施，尤其在大雨過后，要注意監測水質，保持水質清新，嚴防因雨水沖刷而大量進入水體中的檸檬酸桿菌感染水產動物，引發大面積死亡。

本研究中，以濃度1×108mL-1病原菌感染健康棘胸蛙，9 d后棘胸蛙死亡率達到100%，可見檸檬酸桿菌對棘胸蛙有較高的致病性。已有研究表明，檸檬酸桿菌的致病性與其脂多糖結構、致病基因和耐藥基因有較大關系。嚴玉霖等[21]研究發現，內毒素為脂多糖中的主要毒力成分，可在細菌溶解或活躍繁殖時釋放，并引起宿主免疫應答，危害人畜健康。周加利[22]發現，弗氏檸檬酸桿菌脂多糖中的O抗原種類對人和動物有很強的感染力，并且對內毒素的毒力作用有調控能力。白莉[23]在研究中發現，弗氏檸檬酸桿菌可能帶有編碼OmpX-sfaABC-鐵轉運系統等毒力島，對其致病性有極大影響。閻斌倫等[24-28]研究表明，弗氏檸檬酸桿菌引起腹瀉的主要原因可能是攜帶有定居因子抗原cfa基因。但細菌的致病基因與其致病性之間的作用機制仍然不清楚，確定致病基因的作用機理將是今后研究的熱點。

目前對棘胸蛙檸檬酸桿菌的防治方法主要停留在預防為主的階段，如有感染即選用常用抗生素進行治療，但已有研究表明檸檬酸桿菌已對某些藥物產生耐藥性[29-32]，且另有研究表明其毒力有加強的趨勢[33-34]。長此以往，傳統藥物的治療未必能達到較好的療效。因此，今后應當加強對細菌黏附、胞外酶產物、致病基因和耐藥基因的研究，尤其是對強毒力菌株的研究，如致病基因與致病性之間的關系、耐藥基因的作用機理等，以期研發能夠針對性地遏制病原菌黏附，阻斷致病基因或耐藥基因傳遞、表達的抗細菌毒力的新型藥物。