亞麻籽油和低氧處理對大鼠采食量、 葡萄糖和肝臟脂肪利用的影響

趙貴琴，劉雨詩，謝薇薇，白雪蓮，陳雪君

(杭州師范大學 生命與環境科學學院，浙江 杭州 310018)

組織低氧是一種常見的生理和病理狀態，在人體多種器官發病過程中起關鍵作用[1]。低氧使體內原有生物氧化失衡，一定范圍內，機體可通過加強糖酵解、促進血管再生和紅細胞生成等途徑降低低氧對細胞造成的氧化損傷[2]。大量研究發現，低氧應激時，葡萄糖是動物組織和細胞供能的優先底物，糖酵解相關的酶可被低氧誘導因子-1(HIF-1)激活，脂肪分解受阻[3]。人類呼吸暫停綜合癥可誘發非酒精性脂肪肝，說明慢性間隙性低氧抑制機體脂肪利用[4]。但另一些研究則認為，低氧通過調節過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)等通路，促進游離脂肪酸分解提供能量[5]。低氧還可以通過內分泌等調節途徑降低肝臟糖酵解供能比例，增加脂肪酸的氧化利用[6]。適當低氧刺激能促進能量代謝和脂肪分解，改善低氧能量不足[7]。因此，低氧應激時的能量代謝調節是一個復雜的過程，葡萄糖和脂類物質作為供能的底物參與其中，但其作用機制仍不清楚。

亞麻酸(alpha-linolenic acid，ALA)是人體一種必需脂肪酸，屬于n-3系列多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA)，亞麻籽油是ALA 主要天然來源。研究認為，ALA及二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid， EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)等n-3 PUFA是脂肪酸代謝中重要的調節因子，能夠抑制脂肪合成，促進脂肪分解，具有降低血脂等作用[8]。n-3 PUFA還能上調葡萄糖轉運蛋白基因，增加機體對葡萄糖的攝入和利用，參與機體能量代謝調節過程[9]。目前很少有ALA與組織低氧之間的相互作用關系的研究報道。本研究從ALA作為營養調節因子的角度探討大鼠低氧應激時對葡萄糖和脂肪的利用，研究兩者之間可能存在的互作關系，為促進低氧狀態下的機體健康提供可能的營養調節途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

60只30日齡的清潔級雄性SD大鼠購自浙江省醫學科學院動物中心，初始體重為(69.50±0.36)g，于實驗室進行為期1周的適應性飼養，溫度(22±1)℃，相對濕度50%～60%，日光燈調節光照時間為7： 00—19： 00。

1.2 動物飼料

基礎飼料根據《GB 14924.3—2010 實驗動物 配合飼料營養成分》配制，由浙江省醫學科學院動物中心生產提供。飼料含18%粗蛋白，4%粗脂肪，能量14 421 kJ·kg-1。試驗組動物飼料營養水平與基礎日糧相同，僅脂肪來源不同，試驗組用亞麻籽油(2%)替代基礎日糧中的大豆油(2%)。適應期全部動物飼喂基礎飼料。

1.3 處理設計

將60只大鼠隨機分成4組，分別為對照常氧(CN)組、對照低氧(CH)組、試驗常氧(FN)組和試驗低氧(FH)組。對照組飼喂基礎日糧，試驗組飼喂添加亞麻籽油日糧。常氧組在實驗室常壓下飼養，氣壓為101.23 kPa，氧氣含量為20.9%。低氧組低氧艙內處理(每天22.5 h)，模擬海拔高度3 km，氣壓67.2 kPa，氧分壓15.1%。試驗期間每天測體重，記錄大鼠攝食量并更換墊料，計算采食量和日增重。4周后，全部動物處死，取全血自然凝血后，4 000 r·min-1離心15 min，分離血清，同時取動物肝臟和腿部肌肉，所有樣品置于-80 ℃冰箱備用。

1.4 指標測定

1.4.1 血清和肝臟生化指標

測定血清中能量代謝相關指標，包括葡萄糖、丙酮酸、乳酸、總蛋白、白蛋白、尿素氮、總甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、游離脂肪酸、脂肪酸合成酶(FAS)、激素敏感脂酶(HSL)和脂蛋白脂酶(LPL)。以上測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，在SpectraMax M5型酶標儀上測定。

1.4.2 肝臟和肌肉相關基因mRNA實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

肝臟和肌肉組織總RNA提取利用Trzol試劑盒(美國Invitrogen公司)，按說明書操作。Oligo-dT隨機引物進行逆轉錄，采用M-MLV cDNA 逆轉錄試劑盒(美國Promega公司)。qRT-PCR采用實時熒光定量試劑盒(日本TaKaRa公司)，在iQTM5多重實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)上進行。PPARγ和GLUT-4基因引物根據Primer 5.0設計，由上海生物工程技術公司合成，引物序列見表1。以β-actin為參考基因，相對表達量用2-(ΔCt目的基因-ΔCt參考基因)表示。

表1 相關基因的引物序列

1.5 數據處理

所有數據用Statistic 7.0軟件進行雙因子方差分析， Turkey’s HSD進行組間多重比較。P<0.05為有統計學顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 采食量和體增重

各處理對大鼠日采食量和體增重的影響見表2。結果表明，低氧可顯著降低大鼠日采食量和體增重，但亞麻籽油對兩者無顯著影響。低氧和亞麻籽油對日采食量和體增重不存在交互作用。

表2 各處理對大鼠日采食量和體增重的影響

注：同列無相同字母表示差異顯著(P<0.05)。雙因素方差分析,低氧處理P采食量=0.13，P體增重=0.47;亞麻籽油處理P采食量<0.001，P體增重<0.001;低氧×亞麻籽油P采食量=0.64，P體增重=0.58。

2.2 血清糖代謝

表3結果表明，低氧和亞麻籽油對血清葡萄糖、丙酮酸和乳酸均沒有顯著影響，且兩者之間不存在交互作用。

表3 各處理對大鼠血清糖代謝的影響

注：雙因素方差分析,低氧處理P葡萄糖=0.26，P丙酮酸=0.10,P乳酸=0.56;亞麻籽油處理P葡萄糖=0.14，P丙酮酸=0.07,P乳酸=0.41;低氧×亞麻籽油P葡萄糖=0.19，P丙酮酸=0.83,P乳酸=0.39。

2.3 血清蛋白質代謝

表4結果表明，低氧對總蛋白和白蛋白含量無顯著影響，使尿素氮含量顯著升高；亞麻籽油對蛋白質各項代謝指標無影響，但兩者對尿素氮具有交互作用。

表4 各處理對血清蛋白質代謝的影響

注：雙因素方差分析,低氧處理P總蛋白=0.75，P尿素氮=0.17,P白蛋白=0.08;亞麻籽油處理P總蛋白=0.45，P尿素氮<0.001,P白蛋白=0.44;低氧×亞麻籽油P葡萄糖=0.10，P尿素氮<0.01,P白蛋白=0.06。

2.4 血清脂質代謝

亞麻籽油和低氧對大鼠血清脂質代謝的影響見表5。結果表明，低氧和亞麻籽油對血清甘油三酯(TG)和游離脂肪酸(FFA)均沒有顯著影響；兩者均升高高密度脂蛋白(HDL)，降低低密度脂蛋白(LDL)，且低氧和亞麻籽油對兩者具有交互作用。

表5 各處理對血清脂質代謝的影響 mmol·L-1

注：雙因素方差分析,低氧處理P甘油三酯=0.75，P高密度脂蛋白<0.01,P低密度脂蛋白<0.01,P游離脂肪酸=0.55;亞麻籽油處理P甘油三酯=0.12，P高密度脂蛋白<0.01,P低密度脂蛋白<0.05,P游離脂肪酸=0.12;低氧×亞麻籽油P甘油三酯=0.16，P高密度脂蛋白<0.05,P低密度脂蛋白<0.01,P游離脂肪酸=0.53。

2.5 肝臟脂肪代謝相關酶活性

亞麻籽油和低氧對大鼠肝臟脂肪代謝相關酶活性的影響見表6。結果表明，低氧對大鼠肝臟脂肪合成酶(FAS)和激素敏感脂酶(HSL)無顯著影響，使脂蛋白脂酶(LPL)活性顯著升高(P<0.01)。亞麻籽油對大鼠肝臟FAS活性無顯著影響，但顯著升高HSL和LPL活性，且亞麻籽油和低氧對LPL活性存在交互作用。

表6 各處理對大鼠肝臟脂肪代謝相關酶活性的

注：雙因素方差分析,低氧處理P脂肪合成酶=0.69，P激素敏感脂酶<0.01,P脂蛋白脂酶<0.01;亞麻籽油處理P脂肪合成酶=0.88，P激素敏感脂酶=0.11,P脂蛋白脂酶<0.01;低氧×亞麻籽油P脂肪合成酶=0.87，P激素敏感脂酶=0.25,P脂蛋白脂酶<0.01。

2.6 肝臟和肌肉有關基因mRNA

低氧和亞麻籽油都顯著增加了肝臟PPARγ和骨骼肌GLUT-4 mRNA的表達，且兩者對肝臟PPARγmRNA表達有交互作用(表7)。

表7 各處理對大鼠肝臟PPARγ、

注：雙因素方差分析,低氧處理P肝臟PPARγ<0.05，P肌肉GLUT-4<0.05;亞麻籽油處理P肝臟PPARγ<0.05，P肌肉GLUT-4<0.01;低氧×亞麻籽油P肝臟PPARγ<0.05，P肌肉GLUT-4=0.25。

3 討論

3.1 亞麻籽油和低氧對大鼠采食量與體增重的影響

正常情況下，動物的采食量由下丘腦攝食中樞調控。在低氧應急狀態下，內分泌激素如腎上腺素、甲狀腺激素等分泌水平發生改變，一方面降低攝食量，另一方面增加能量消耗，導致體重減輕[10]。動物持續的低氧刺激或人類由平原進入高原地區，會引起食欲下降，體重減輕[11]。本試驗結果發現，模擬3 000 m高原低氧處理4周，大鼠平均體增重顯著下降，采食量顯著降低，尿素氮顯著增加。已有研究表明，低氧刺激引起脂肪分解增加，導致大鼠白色脂肪細胞體積變小，總脂肪含量降低體重下降[12]。Hashimoto等[13]研究發現，低氧條件(5%氧氣)培養3T3-L1脂肪細胞1周后，脂肪細胞變小，甘油三酯含量降低50%。本研究發現，低氧引起肝臟PPARγmRNA表達增加，LPL活性增加，促進了脂肪的分解。因此，低氧刺激作用下大鼠攝食量減少，組織蛋白質、脂肪分解增加，導致動物平均體增重低于常氧組。本試驗條件下，亞麻籽油對體增重和采食量沒有影響，和低氧也不存在交互作用，但有促進肝臟PPARγmRNA表達增加，且與低氧具有交互作用，進一步促進脂肪分解。

3.2 低氧和亞麻籽油對大鼠葡萄糖利用的影響

本研究發現，模擬3 000 m高原低氧處理4周和亞麻籽油日糧均顯著增加了骨骼肌GLUT-4 mRNA表達，但對血清糖代謝各項指標與對照組相比無顯著差異。低氧狀態下，大鼠血糖水平、肝臟和骨骼肌對葡萄糖的攝取和利用不同的研究有不同的結果，可能與低氧處理時間、低氧程度、血糖檢測時間點等不同相關。機體在低氧條件下，氧氣供應不足，氧化還原酶系統活性降低，三羧酸循環受阻，糖酵解增強，脂肪被動員用于肌肉的氧化供能同時血脂濃度降低[14]。 趙成玉等[15]研究發現，在低氧條件下肝臟和胰腺GLUT-4 mRNA 表達明顯增加，肝臟和肌肉對葡萄糖的攝取和利用增加，同時糖異生減少，使血糖降低。本研究發現，低氧增加了骨骼肌GLUT-4 mRNA表達，有增加葡萄糖利用的作用，但這種促進作用比較有限，并沒有引起血糖的降低。Carreras等[16]研究發現，間歇低氧可以影響 GLUT-4 蛋白由胞質到胞膜的易位過程，使胞膜GLUT-4 蛋白含量下降，從而影響骨骼肌攝取葡萄糖，導致胰島素抵抗，使葡萄糖的攝取和利用減少，血糖升高[17]。對運動員在模擬3 000 m高原環境訓練的研究卻得到相反的結果，低氧顯著提高血漿胰島素與胰高血糖素的比例，導致血糖利用增加，而脂類的分解降低、合成增加，血漿游離脂肪酸降低[18]。

3.3 低氧與亞麻籽油對脂肪利用的影響

研究發現，模擬3 000 m高原低氧處理4周對大鼠血漿TG和FFA水平沒有顯著影響，HDL升高而LDL下降，肝臟LPL活性提高。LPL主要作用是將血漿脂蛋白(主要是乳靡微粒和極低密度脂蛋白)中的甘油三酯降解形成脂肪酸，用于氧化分解，降低LDL，升高HDL[19]。在低氧應激過程中，一些激素或細胞因子起著重要作用，PPAR-γ是具有廣泛生理功能的脂肪細胞轉錄因子，參與多條脂肪代謝通路。本研究發現，低氧促進肝臟PPAR-γmRNA表達的提高，進而影響LPL等下游一系列脂肪代謝相關酶基因。路瑛麗等[7]研究發現，嚙齒類動物低氧訓練使骨骼肌中PPARs和肉堿酯酰轉移酶(CPT1)mRNA的表達升高，增加骨骼肌線粒體中脂肪酸的β-氧化。但是低氧處理對脂質代謝的影響也有不同的結果。對人類呼吸暫停綜合癥的研究發現，慢性間歇性低氧導致胰島素抵抗，使血液游離脂肪酸和葡萄糖水平升高，產生氧化應激，最終導致非酒精性脂肪肝[4]。低氧通過降低CPT1 mRNA和蛋白質表達，抑制長鏈脂肪酸向線粒體轉運，減少脂肪β-氧化，導致脂肪在肝細胞沉積，但脂肪合成沒有影響[6]。

亞麻籽油促進了大鼠肝臟PPAR-γmRNA表達的提高，進一步使肝臟LPL和HSL活性升高，升高了HDL，降低了LDL，其中對LPL活性的影響與低氧具有交互作用，但對TG和FFA沒有顯著影響。研究發現，富含DHA的魚油對脂質代謝的調節是通過PPARs途徑，升高動物肝臟和血漿的LPL，從而升高HDL[20-21]。ALA屬于n-3系列PUFA，在動物和人體內可以通過碳鏈延長和去飽和作用合成EPA和DHA，但目前對亞麻籽油調節脂質代謝的研究遠不如魚油多。Fukumitsu 等[22]通過3T3L-1細胞系研究發現，ALA通過SREBP途徑抑制FAS活性，減少膽固醇和甘油三酯合成，同時使CPT1 and瘦蛋白水平升高，促進脂肪分解利用，細胞內ATP增加。Barrena 等[23]認為，ALA具有抑制動物高脂飲食引起的糖類和脂類代謝紊亂作用。

綜上所述，本試驗低氧艙模擬3 000 m高原環境低氧處理大鼠4周，降低大鼠采食量，增加蛋白質和脂肪分解，增加能量消耗、降低體增重。添加亞麻籽油對采食量和蛋白質代謝沒有影響，但通過增加PPAR-γmRNA表達，提高LPL和HSL活性增加脂肪利用，改善低氧能量供應。