K+ Concentration-Dependent Conformational Change of Pb2+-Stabilized G-quadruplex

YU Ze , LI Xiaohong ,＊, LI Yunchao ,＊, YE Mingfu

1 College of Chemistry, Beijing Normal University, Beijing 100875, P. R. China.

2 School of Chemistry and Chemical Engineering, Anhui University of Technology, Maanshan, 243002, Anhui Province, P. R. China.

Abstract: DNA can adopt a diverse range of structural conformations, including duplexes, triplexes, and quadruplexes. Among these structures, G-quadruplexes have attracted much more attention of researchers. For G-rich DNA sequences,they can fold into multiple G-quadruplex conformations, such as parallel,antiparallel, or hybrid, and the exact conformation is influenced by G-rich DNA sequence, strand concentration, and binding cations. Among the factors influencing the G-quadruplex conformation and stability, cations played a really important role. Numerous studies have reported cation-dependent stability and topological changes of G-quadruplexes; however, most of studies have focused on the effect of individual cation (such as charge, radii, or hydration, etc.), and only few have assessed the effect of competition between cations at different concentrations. Actually, most biological and aqueous systems contained multiple cations and each of the cations had very different concentrations. Thus, investigation of the competitions between different cations (at different concentrations) for binding with G-quadruplexes and their effects on polymorphism of G-quadruplex is critical, which would improve our understanding of the roles of G-quadruplexes and assist us in further exploring their potential applications in biochemical, biomedical, and environmental systems. Under this situation, we focused on K+- and Pb2+-stabilized G-quadruplex, two major cations that are usually used to stabilize G-quadruplex. It has been shown that for a given G-quadruplex forming DNA sequence,Pb2+-stabilized G-quadruplex was more stable than K+-stabilized G-quadruplex, and Pb2+ could substitute K+ in K+-stabilized G-quadruplex. However, the concentrations of K+ that allow such a substitution are not completely studied.Previous studies have used G-quadruplex-based fluorescent, colorimetric, and electrochemical sensors for detecting Pb2+,and these methods show excellent selectivity for Pb2+ over K+. Although G-quadruplex-based Pb2+ sensors were developed, their applications in real samples containing K+ were greatly limited. Thus, how K+ and Pb2+ compete for binding to G-quadruplex and how K+ concentrations affect the stability of Pb2+-stabilized G-quadruplex remain elusive. In this study, eight G-rich DNA sequences were selected to investigate the effect of K+ concentration on Pb2+-stabilized G-quadruplex. Previous studies have established that the presence of K+ cannot alter the stability of Pb2+-stabilized G-quadruplex. In contrast to this, our results indicated that K+ could induce a conformational switch in Pb2+-stabilized T2TT (G-rich DNA sequence, forming G-quadruplex in the presence of Pb2+), and further replace Pb2+ in Pb2+-stabilized T2TT and transform it into 2K+-stabilized T2TT, which is strictly K+ concentration-dependent. Importantly, such a conformational switch could be observed for other seven selected G-rich sequences as well. Therefore, our findings provide a new insight into the exchange and competition of cations in G-quadruplex.

Key Words: Lead ion; Potassium ion; G-quadruplex; G-rich DNA sequence; Conformational switch

1 引言

G-四鏈體(G4)是由陽(yáng)離子誘導(dǎo)富G核酸適體鏈形成的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)1。人體中有大量的富G序列，主要分布于端粒和原癌基因啟動(dòng)子區(qū)域，這些序列與細(xì)胞調(diào)控過(guò)程緊密相關(guān)2。另外，目前已有許多人工合成的富G序列用于設(shè)計(jì)發(fā)展納米材料和分子器件3–14。G4的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)直接影響到其在體內(nèi)的生物功能和體外的生化應(yīng)用。其中，金屬離子誘導(dǎo)富G核酸適體鏈形成G4的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，是決定G4性質(zhì)和功能的主要因素之一，因此，金屬離子誘導(dǎo)富G適體鏈形成G4的構(gòu)型研究廣受關(guān)注15,16。

近年來(lái)，關(guān)于離子依賴的G4穩(wěn)定性和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的變化，一部分集中于單一離子的影響17–24，一部分集中于共存離子的影響25–28。基于在生物體系以及大部分的水相體系均含有不同濃度和不同種類的離子，研究共存離子對(duì)G4結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響更具有普遍的科學(xué)意義。據(jù)相關(guān)報(bào)道，相比于K+穩(wěn)定的G4結(jié)構(gòu)(K+-G4))，Pb2+穩(wěn)定的G4結(jié)構(gòu)(Pb2+-G4)具有良好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性17–19,22,29–38。因此，基于Pb2+不可逆地置換K+-G4中的K+，相繼報(bào)道了一系列的離子檢測(cè)傳感器34,38–41以及邏輯器件31,32,37。然而，在這些研究工作中，均未考慮K+對(duì)Pb2+-G4構(gòu)型和穩(wěn)定性的影響。

在本文中，通過(guò)系統(tǒng)地研究不同濃度鉀離子對(duì)穩(wěn)定Pb2+-G4構(gòu)型的影響，發(fā)現(xiàn)K+不僅會(huì)改變Pb2+-G4的構(gòu)型，而且會(huì)置換其結(jié)構(gòu)中的Pb2+進(jìn)而形成K+-G4，這一影響表現(xiàn)出K+濃度依賴性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于不同的富G適體鏈，這一轉(zhuǎn)化規(guī)律具有一定的普適性。研究結(jié)果闡明了Pb2+-G4的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性對(duì)K+濃度的依賴性。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí)驗(yàn)中使用的 DNA由上海生工生物有限公司合成，具體序列如下所示：

T2TT: 5’-GGGTTGGGTGGGTGGG-3’

PW17 (PW17212): 5’-GGGTAGGGCGGGTT GGG-3’

PW17111: 5’-GGGAGGGCGGGTGGG-3’

PW17211: 5’-GGGTAGGGCGGGTGGG-3’

PW17222: 5’-GGGTAGGGCTGGGTTGGG-3’

TBA: 5’-GGTTGGTGTGGTTGG-3’

Oxy28: 5’-GGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTT TTGGGG-3’

PS2.M: 5’-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’

三羥甲基氨基甲烷Tris，高氯酸鉀，氯化鉀，三水合高氯酸鉛，均購(gòu)于Sigma-Aldrich公司，并可直接使用。冰醋酸購(gòu)于北京化工廠，并可直接使用。所有試劑均為分析純，使用之前不再經(jīng)過(guò)任何純化。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用水均為Millipore Milli-Q system (Thermo Scientific EASYpure)微孔過(guò)濾器過(guò)濾后的去離子水(電阻率為18.2 M?·cm)。

DNA母液的配制：用10 mmol·L-1Tris-HAc緩沖溶液(pH = 8.0)配制 100 μmol·L-1DNA，不同濃度的DNA溶液用10 mmol·L-1Tris-HAc緩沖溶液(pH = 8.0)稀釋可獲得。

2.2 圓二色光譜法

室溫 25 °C下，用 Chirascan型圓二色譜儀(Applied Photophysics Ltd)測(cè)量 4 μmol·L-1DNA 與10 μmol·L-1鉛離子(作用 1 h)的圓二色光譜；隨后，再考察加入不同濃度鉀離子(作用 1 h)的圓二色譜。測(cè)試液定容 1000 μL，4 μmol·L-1DNA 用 100 μmol·L-1DNA 母液稀釋獲得，將 Pb(ClO4)2母液用緩沖溶液稀釋至 100 μmol·L-1，后加 100 μL 至DNA中，不同濃度的鉀離子用濃度為50 mmol·L-1KClO4溶液作為母液進(jìn)行稀釋獲得，剩余體積的反應(yīng)液為緩沖溶液，反應(yīng)液加至 1000 μL后用混勻器使其充分混勻，靜止使其充分反應(yīng)后測(cè)圓二色譜。比色皿光路長(zhǎng)度為1 cm，體積為800 μL。測(cè)試過(guò)程中通入高純氮，掃描范圍為 220–340 nm，每個(gè)測(cè)試波長(zhǎng)的停留時(shí)間為 0.5 s，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)試兩次，最終譜圖需扣除測(cè)試緩沖液的背景。

2.3 電噴霧離子化質(zhì)譜法

質(zhì)譜樣品配制：如上述樣品配制，先配置 4 μmol·L-1的 DNA 樣品，在進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)前加入TMAA (最終為 100 mmol·L-1和甲醇(最終為 20%)。質(zhì)譜條件：電噴霧電壓 2.5 kV，毛細(xì)管溫度為150 °C。HPLC 作為自動(dòng)進(jìn)樣器，流速 2.50 μL·min-1。所得結(jié)果使用ProMass軟件解卷積處理。

3 結(jié)果與討論

據(jù)報(bào)道，10 μmol·L-1Pb2+可以誘導(dǎo)富 G 的核酸適體鏈形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)(G4)6–9。以T2TT適體鏈為例，以圓二色光譜表征其在Pb2+和K+存在條件下的構(gòu)形轉(zhuǎn)化。如圖1a所示，在10 μmol·L-1Pb2+存在條件下，T2TT在310 nm處，出現(xiàn)一個(gè)正峰；同時(shí)，在260 nm處出現(xiàn)一個(gè)正峰，在243 nm處出現(xiàn)一個(gè)負(fù)峰，表明 T2TT適體鏈在 Pb2+的誘導(dǎo)下形成了雜合結(jié)構(gòu)的G429,30,32,34,39,41–43。隨后，在該體系中，逐漸加入0到1 mmol·L-1K+，可以觀察到：(1) 在310 nm處的正峰逐漸減弱并向短波方向移動(dòng)；(2) 在260 nm處的正峰逐漸增強(qiáng)并向長(zhǎng)波方向移動(dòng)至265 nm處；(3) 在243 nm處的負(fù)峰，逐漸增強(qiáng)。結(jié)果表明，隨著K+濃度的逐漸增加，Pb2+穩(wěn)定的T2TT所形成的G4結(jié)構(gòu)，逐漸轉(zhuǎn)化為平行的 G4結(jié)構(gòu)。當(dāng) K+的濃度達(dá)到 1 mmol·L-1時(shí)，平行的 G4 特征峰與單獨(dú) 1 mmol·L-1K+存在條件下的G4特征峰相同，如圖1b所示。隨后，采用電噴霧離子化質(zhì)譜(ESI-MS)進(jìn)一步表征 T2TT 適體鏈分別在 10 μmol·L-1Pb2+，1 mmol·L-1K+，以及 10 μmol·L-1Pb2+和 1 mmol·L-1K+條件下所形成G4結(jié)構(gòu)中內(nèi)嵌離子的種類，結(jié)果如圖 1c所示。在 10 μmol·L-1Pb2+存在條件下，T2TT適體鏈質(zhì)核比為5312 (5105 + 207)，對(duì)應(yīng)于Pb2+誘導(dǎo)T2TT形成的G4結(jié)構(gòu)；隨著K+濃度的增加，質(zhì)核比為5312處的特征峰逐漸降低，并在質(zhì)核比為5182 (5105 + 39 + 39)處出現(xiàn)了一個(gè)新峰且逐漸增加，對(duì)應(yīng)于K+誘導(dǎo)T2TT形成的G4結(jié)構(gòu)。當(dāng) K+濃度達(dá)到1 mmol·L-1時(shí)，質(zhì)核比為5312處的特征峰完全消失。由此可以推測(cè)，K+取代了G4結(jié)構(gòu)中的Pb2+。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Pb2+穩(wěn)定的G4結(jié)構(gòu)(Pb2+-G4)，其熱力學(xué)穩(wěn)定性要高于 K+穩(wěn)定的 G4結(jié)構(gòu)(K+-G4)3–21，因此Pb2+可以置換K+-G4結(jié)構(gòu)中的K+，但是K+的存在并不影響Pb2+-G4的穩(wěn)定性。這一研究結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，K+的存在不僅影響了 Pb2+-G4結(jié)構(gòu)的構(gòu)型和穩(wěn)定性，而且還可以置換出Pb2+-G4結(jié)構(gòu)中的Pb2+。

圖 1 4 μmol·L-1 T2TT (a)在 10 μmol·L-1 Pb2+以及不同濃度鉀離子(0.02–1 mmol·L-1)加入到 10 μmol·L-1 Pb2+體系中的圓二色譜圖（由紅到紫）；(b) 1 m mol·L-1 K+加入到 10 μmol·L-1 Pb2+體系中(黑線)與單獨(dú) 1 mmol·L-1 K+存在條件下(紅線)的圓二色譜圖；(c) 10 μmol·L-1 Pb2+以及 10 μmol·L-1 Pb2+穩(wěn)定后加入不同濃度 K+以及單獨(dú)1 mmol·L-1 K+存在條件下的質(zhì)譜圖Fig. 1 (a) CD spectra of 4 μmol·L-1 T2TT in the presence of 10 μmol·L-1 Pb2+ and adding K+ (0.02 to 1 mmol·L-1) to 10 μmol·L-1 Pb2+ system (from red to purple); (b) CD spectra of adding 1 mmol·L-1 K+ to 10 μmol·L-1 Pb2+ system(black) and that in the presence of only 1 mmol·L-1 K+(red); (c) ESI-MS of T2TT in the presence of 10 μmol·L-1 Pb2+with the subsequent addition of different concentrations of K+ (0.02 to 1 mmol·L-1), and in the presence of only 1 mmol·L-1 K+ (from top to bottom).

為了研究這一轉(zhuǎn)化規(guī)律的普適性，將核酸適體鏈擴(kuò)展到其他的適體鏈，如 PW17212，以及PW17212的衍生序列(通過(guò)變化富G單元之間的堿基個(gè)數(shù))，如PW17111(富G單元之間堿基個(gè)數(shù)為1)，PW17211和 PW17222，分別研究在 Pb2+，K+以及 Pb2+和 K+同時(shí)存在的情況下，G4結(jié)構(gòu)的構(gòu)型轉(zhuǎn)化。

10 μmol·L-1的鉛離子誘導(dǎo) 4 μmol·L-1PW17212(核酸適體鏈)發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)變，結(jié)果如圖 2a所示。在圓二色圖譜中，在310 nm處出現(xiàn)一個(gè)正峰，在265 nm處出現(xiàn)一個(gè)負(fù)峰，對(duì)應(yīng)于反平行G4結(jié)構(gòu)的特征峰。由此可以推斷，10 μmol·L-1的鉛離子誘導(dǎo) 4 μmol·L-1PW17212形成了反平行的 G4 結(jié)構(gòu)(Pb2+-PW17212)。隨后，在該體系中，逐漸加入0–20 mmol·L-1K+，反平行 Pb2+-PW17212結(jié)構(gòu)在 310 nm處的正峰和在265 nm處的負(fù)峰逐漸減弱；相應(yīng)地，在265 nm處的正峰逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)出了平行 G4結(jié)構(gòu)的特征峰。當(dāng) K+的濃度增加到 20 mmol·L-1時(shí)，Pb2+-PW17212的構(gòu)型完全轉(zhuǎn)化為平行的 G4，此時(shí)的 G4圓二色特征峰與單獨(dú) 20 mmol·L-1K+誘導(dǎo) 4 μmol·L-1PW17212形成平行的G4 (K+-PW17212)特征峰基本吻合。接著，將核酸適體鏈由 PW17212變化成 PW17111、PW17211、PW17222，在同樣的條件下，研究K+對(duì)Pb2+-G4構(gòu)型的影響。對(duì)于 PW17111(圖 2b)，Pb2+-PW17111是一個(gè)部分反平行的G4結(jié)構(gòu)，隨著K+的不斷加入，反平行的特征逐漸減弱，平行的特征逐漸增加。當(dāng)K+濃度達(dá)到0.5 mmol·L-1時(shí)，部分反平行的Pb2+-PW17111完全轉(zhuǎn)化為平行的G4結(jié)構(gòu)。對(duì)于PW17211(圖2c)，Pb2+-PW17211是一個(gè)反平行的G4結(jié)構(gòu)，隨著K+的不斷加入，反平行的特征逐漸減弱，平行的特征逐漸出現(xiàn)，并不斷增強(qiáng)。當(dāng)K+濃度達(dá)到2 mmol·L-1時(shí)，反平行的Pb2+-PW17211完全轉(zhuǎn)化為平行的G4結(jié)構(gòu)。對(duì)于PW17222(圖2d)，Pb2+-PW17222是一個(gè)反平行的 G4結(jié)構(gòu)，隨著 K+的不斷加入，反平行的特征逐漸減弱，平行的特征逐漸出現(xiàn)，并不斷增強(qiáng)。當(dāng) K+濃度達(dá)到 50 mmol·L-1時(shí)，反平行的 Pb2+-PW17222完全轉(zhuǎn)化為平行的G4結(jié)構(gòu)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，對(duì)于一系列的PW17適體鏈，因富G單元之間堿基數(shù)的不同，雖然K+均可以誘導(dǎo)Pb2+-G4發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)變，但是需要K+的濃度，則各不相同，隨著富G單元間堿基個(gè)數(shù)的增加，發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)變需要K+濃度的閾值逐漸增加。在保持富G重復(fù)單元保持不變的情況下，通過(guò)變化富G重復(fù)單元之間的堿基個(gè)數(shù)，發(fā)現(xiàn)K+依然可以誘導(dǎo)Pb2+-G4發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)化。

圖 2 PW17212 (a)以及 PW17111 (b)、PW17211 (c)和 PW17222 (d)在 10 μmol·L-1 鉛離子和向 10 μmol·L-1 鉛離子穩(wěn)定G4中加入不同濃度(mmol·L-1)鉀離子的圓二色譜圖Fig. 2 CD spectra of PW17212 (a), PW17111 (b), PW17211 (c) and PW17222 (d) in the presence of 10 μmol·L-1 Pb2+and adding different concentration of K+ to 10 μmol·L-1 Pb2+ system.

圖 3 4 μmol·L-1 TBA (a)、PS2.M (b)和 Oxy28 (c)在 10 μmol·L-1 Pb2+ (藍(lán)線)、10 mmol·L-1 K+ (紅線)和向 10 μmol·L-1鉛離子穩(wěn)定G4中加入10 mmol·L-1 K+ (紫線)的圓二色譜圖Fig. 3 CD spectra of 4 μmol·L-1 TBA(a), PS2.M (b) and Oxy28 (c) in the presence of 10 μmol·L-1 Pb2+ (blue), in the presence of 10 mmol·L-1 K+ (red) and adding 10 mmol·L-1 K+ to 10 μmol·L-1 Pb2+ system (purple).

最后，將適體鏈擴(kuò)展到不同的富G重復(fù)單元，如含有兩個(gè)G的重復(fù)單元TBA (圖3a)，含有三個(gè)G的重復(fù)單元PS2.M (圖3b)，含有四個(gè)G的重復(fù)單元 Oxy28 (圖3c)。對(duì)于TBA適體鏈，如圖3a所示，在 10 μmol·L-1鉛離子存在條件下，TBA 形成反平行的G4結(jié)構(gòu)，在10 mmol·L-1K+存在條件下，形成平行的G4結(jié)構(gòu)，在反平行的G4體系中，加入10 mmol·L-1K+，反平行的G4構(gòu)型轉(zhuǎn)化為平行的G4構(gòu)型。對(duì)于PS2.M適體鏈，如圖3b所示，在10 μmol·L-1鉛離子存在條件下，PS2.M形成反平行的G4結(jié)構(gòu)，在反平行的G4體系中，加入10 mmol·L-1K+，反平行的G4構(gòu)型轉(zhuǎn)化為平行的G4構(gòu)型。對(duì)于Oxy28，如圖3c所示，在10 μmol·L-1鉛離子存在條件下，Oxy28形成反平行的G4結(jié)構(gòu)，在10 mmol·L-1K+存在條件下，形成平行的G4結(jié)構(gòu)，在反平行的G4體系中，加入10 mmol·L-1K+，反平行的G4構(gòu)型轉(zhuǎn)化為平行的G4構(gòu)型。由此可以看出，對(duì)于含有不同富G重復(fù)單元的適體鏈，依然可以觀察到K+誘導(dǎo)Pb2+-G4的構(gòu)型轉(zhuǎn)化。

4 結(jié)論

綜上所述，K+不僅可以誘導(dǎo)Pb2+穩(wěn)定G-四鏈體(Pb2+-G4)發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)化，而且會(huì)進(jìn)一步取代Pb2+-G4中的 Pb2+形成 K+-G4，構(gòu)型轉(zhuǎn)化后的 G4結(jié)構(gòu)與單獨(dú)K+誘導(dǎo)適體鏈形成K+-G4的構(gòu)型基本一致。這種構(gòu)型轉(zhuǎn)化以及離子取代過(guò)程具有鉀離子濃度依賴性。重要的是，這一轉(zhuǎn)化趨勢(shì)具有一定的普適性，與適體鏈中富G重復(fù)單元中G堿基的個(gè)數(shù)，以及與富G重復(fù)單元之間的堿基個(gè)數(shù)關(guān)系不大。上述研究結(jié)果為研究G四鏈體構(gòu)形轉(zhuǎn)化和內(nèi)嵌離子交換提供了新的視角，也為拓展 G4在生物分析和生化應(yīng)用提供了新的理論基礎(chǔ)。