漢黃芩素對食管癌KYSE150細胞周期和凋亡的影響※

● 黃偉鋒 盧春敬 許光輝

食管癌主要有兩種類型，即鱗狀細胞癌和腺癌。在我國，90%以上為鱗狀細胞癌，而國外腺癌占比較多，是消化系統常見的惡性實體瘤。它是我國癌癥死亡的第四大原因，也是世界十大癌癥之一[1]。

目前腫瘤化療存在的兩個主要問題是化療的副作用和多重耐藥性的發展，因此，最小化副作用和最大化功效已成為開發新的抗腫瘤藥物的主要目標。中藥最近被認為是開發抗癌藥物的新來源，并作為一種新的化療佐劑來提高療效或改善目前癌癥化療的副作用。近年來研究發現，許多中藥的有效成分能在腫瘤細胞周期的某一階段發生作用，從而阻滯細胞增殖，或(和)誘導細胞凋亡[2]，進而發揮良好的抗腫瘤作用，而對正常細胞無毒副作用。漢黃芩素(5，7-二羥基-8-甲氧基黃酮，wogonin)是一種黃酮類化合物，研究發現，其對多種腫瘤有抑制作用，包括多發性骨髓瘤[3]、肺腺癌[4]、膠質瘤[5]、肝癌[6]、胃癌[7]、乳腺癌[8]等。其抗腫瘤分子機制包括：上調細胞內ROS水平，下調PI3K-AKT信號通路，調節MAPKs，上調p53，抑制NF-κB信號通路，抑制GSK-3β活化以及ΔNp63的表達等[9]。本實驗主要研究漢黃芩素抑制食管癌細胞生長的機制，為漢黃芩素應用于臨床抗腫瘤提供理論依據。

1 材料和方法

1.1細胞培養人食管鱗狀細胞癌細胞株KYSE150，購自凱基生物(ATCC；Rockville，MD，USA)，培養于含有10%熱滅活胎牛血清(Gibco by Life Technologies，Carlsbad，CA，美國)的RPMI 1640培養基中，培養箱條件控制為37°C，95%空氣/5%CO2，95%濕度。

1.2細胞增殖實驗收集處于對數期生長的KYSE150細胞，種植于96孔板中，每孔大約5×103細胞(為了減少液體蒸發，培養板周邊的孔用PBS填充)，培養箱培養3h使細胞貼壁。用不同濃度的漢黃芩素處理細胞(漢黃芩素溶解于DMSO，DMSO終濃度小于0.1%)，每個濃度的藥物設3個復孔。培養48h后，每孔加入20μL Cell Titer 96 AQ One Solution Reagent(Promega，Madison，WI，USA)，繼續培養2h。酶標儀(MD SpectraMax M3，CA，USA)測量各孔的OD490nm和OD 650nm吸光值，實驗至少重復三次。

1.3細胞周期實驗收集不同濃度漢黃芩素處理的KYSE150細胞和空白對照組細胞，大約每組1×106個細胞。參考細胞周期檢測試劑盒說明(Keygen Biotech，Nanjing，China)，將體積分數為70%冷乙醇500μL加入到細胞中，固定細胞2小時至過夜，放置于4℃冰箱保存，染色前用PBS將固定液洗去，加入100μlRNase A 37℃水浴30min。最后加入400μL PI染色混勻，4℃避光 30 min，上機檢測，流式細胞儀記錄激發波長488 nm處紅色熒光(BD Accuri C6，Ann Arbor，MI，USA)。用FlowJo software軟件分析細胞周期。

1.4細胞凋亡實驗收集不同濃度漢黃芩素處理的KYSE150細胞和空白對照組細胞，大約每組1×106個細胞。參考細胞凋亡檢測試劑盒(Keygen Biotech，Nanjing，China)，加入5μL Annexin V-FITC 混合均勻后，加入5μL Propidium Iodide混勻，室溫、避光、令其反5～15min，流式細胞儀上機檢測，記錄激發波長488nm處的FL1和FL3。

2 結果

2.1漢黃芩素對KYSE150細胞生長的影響細胞增殖實驗表明，漢黃芩素處理KYSE150細胞48h后，細胞的生長受到抑制，且隨著藥物濃度的增大，其抑制生長作用越大。漢黃芩素大于25μM的實驗組與對照組相比均有統計學差異(P<0.05)，漢黃芩素10μM組的抑制作用與對照組相比無統計學差異(P>0.05)(表1)。漢黃芩素作用48h的IC50=(68.59±3.43)μM。

表1 漢黃芩素對KYSE150細胞生長的抑制作用

注：P值為加藥組與對照組(Control)相比

2.2漢黃芩素對KYSE150細胞周期的影響為了研究漢黃芩素抑制KYSE150細胞生長的作用機制，筆者進行了細胞周期實驗。實驗結果表明漢黃芩素作用于KYSE150細胞48h后，可以顯著抑制KYSE150細胞增殖，表現為細胞周期G0/G1期所占的比例顯著增加，而G2期細胞數顯著降低。另外，高濃度的漢黃芩素(100μM)能夠顯著增加亞G1期(凋亡細胞)的細胞比例(圖1、圖2)。

圖1 漢黃芩素作用48h后KYSE150細胞周期的變化

注：A：Control；B：50μM Wogonin；C：100μM Wogonin

圖2 漢黃芩素作用48h后KYSE150細胞周期的變化柱狀圖

注：與對照組比較，*P<0.05

2.3漢黃芩素對KYSE150細胞凋亡的影響在研究細胞周期實驗中筆者發現高濃度的漢黃芩素可以增加亞G1期(凋亡細胞)的細胞比例，為了進一步研究漢黃芩素對KYSE150細胞凋亡的影響，筆者利用流式細胞技術進行了細胞凋亡實驗。實驗結果表明，漢黃芩素干預48h后，漢黃芩素50、100μM組的細胞早期凋亡率均顯著高于對照組(P<0.05)，且漢黃芩素的濃度越高，細胞凋亡率也越高，有明顯的劑量依賴關系(圖3，圖4)。

圖3 漢黃芩素作用48h后KYSE150細胞凋亡分析

注：X軸代表AV-FITC染色，Y軸代表PI染色。LR和UR區域的百分比分別代表AV陽性/PI陰性(早期凋亡)和AV陽性/PI陽性細胞(晚期凋亡)。A：Control；B：50μM Wogonin；C：100μM Wogonin

圖4 漢黃芩素作用48h后KYSE150細胞凋亡分析柱狀圖

注：與對照組比較，*P<0.05

3 討論

惡性腫瘤作為全球較大的疾病之一，嚴重危害人類的健康，是新世紀人類健康的第一殺手。當今世界，隨著經濟的發展、生活節奏的加快、不良的生活方式以及環境的污染等問題，惡性腫瘤的發病率呈上升趨勢[10]。中藥學是我國醫藥事業的偉大傳承之一，漢黃芩素(5，7-二羥基-8-甲氧基黃烷酮)是從黃芩(唇形科)中提取的天然黃酮類化合物，在體外和體內具有特別有效的抗腫瘤活性。有趣的是，漢黃芩素對正常細胞或組織沒有毒性或輕微毒性[11，12]。由于其對腫瘤細胞系的選擇性毒性，漢黃芩素成為一種有吸引力的候選藥物，是一種潛在的新型抗腫瘤藥物。

本次實驗研究了中藥單體漢黃芩素對食管癌KYSE150細胞生存的影響，并對其可能的機制進行初步探討。漢黃芩素對KYSE150細胞的生長有明顯的抑制作用，并有劑量依賴性，與楊莉[13]對漢黃芩素抗腫瘤作用研究進展的報告中關于漢黃芩素能呈劑量、時間依賴性地抑制細胞增殖的觀點相符合。細胞周期檢測表明，漢黃芩素能使KYSE150細胞發生G1期阻滯，從而表明干擾細胞周期進程是漢黃芩素影響腫瘤細胞增殖的機制之一。另外，流式細胞術檢測細胞凋亡顯示，隨著漢黃芩素劑量的增大，凋亡細胞比例變大。蘆曦[7]等研究漢黃芩素對SGC7901細胞增殖和侵襲活性的影響，發現漢黃芩素對SGC7901細胞生長有明顯抑制作用，其抑制細胞生長的IC50為(74.26±1.21)μM，與本實驗得出的IC50=(68.59±3.43)μM相近。本實驗結果表明漢黃芩素作用48h后，影響腫瘤細胞周期分布，使S期、G2/M期細胞比例減少，G0/G1期細胞比例增大，表明漢黃芩素將腫瘤細胞的細胞周期阻滯于G0/G1期，進而抑制細胞增殖。在個體發育過程中細胞的凋亡受基因調控，是一種細胞自殺活動。惡性腫瘤的生物學特征包括細胞增殖過度、細胞凋亡受阻，研究表明漢黃芩素的抗腫瘤作用與誘導腫瘤細胞凋亡有關[9]。許多文獻表明，漢黃芩素誘導腫瘤細胞凋亡的機制可能與調節細胞凋亡相關基因的表達有關，例如Bcl-2、p53、survivin等[14]。

綜上所述，漢黃芩素能夠抑制食管癌SGC7901細胞的生長，其機制可能是通過阻滯細胞周期進程和誘導細胞凋亡。這為漢黃芩素將來用于治療食管癌提供理論依據。