大白菜、蘿卜蕪菁花葉病毒系統進化及CP序列分析

吳斌　張眉 姜珊珊 張安盛 崔漢青 辛志梅 馬立平 王升吉

摘要：2015—2017年對采自山東、河南、遼寧、黑龍江及陜西等省份的具有TuMV癥狀的大白菜、蘿卜樣品進行檢測，測序獲得了214個TuMV CP序列。系統進化分析顯示3個特點：各地大白菜、蘿卜TuMV CP序列分離物大致歸屬于world-B和basal-BR 2個組；TuMV分離物歸屬既有寄主關聯性，又有地域性；同一地點的物種內TuMV分離物表現較好的一致性，但也存在多樣性。研究結果為十字花科蔬菜抗TuMV育種提供理論依據。

關鍵詞：大白菜；蘿卜；蕪菁花葉病毒；系統進化；序列分析

中圖分類號：S436.341.1+1+S436.31 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2018）08-0100-06

Phylogenetic Evolution and CP Nucleotide Sequence Analysis of

TuMV in Chinese Cabbage and Radish

Wu Bin1， Zhang Mei1， Jiang Shanshan1， Zhang Ansheng1，

Cui Hanqing2， Xin Zhimei1， Ma Liping2， Wang Shengji1

（1. Institute of Plant Protection， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Key Laboratory of Plant Virology，

Jinan 250100， China；2. Vocational Secondary Professional School of Pingdu City， Pingdu 266752， China）

Abstract Chinese cabbage and radish samples with TuMV symptoms were collected from Shandong， Henan， Liaoning， Heilongjiang and Shaanxi Province in 2015-2017， and 214 CP sequences of TuMV （Turnip mosaic virus） were obtained by detection. Phylogenetic analysis showed three characteristics. The first， TuMV CP sequences of all isolates were assigned to two groups that were world-B and basal-BR. The second， the ascription of TuMV isolates had not only host association but also regional correlation. The last， TuMV isolates of the same place showed good consistency and a certain extent of diversity. The research provided theory evidences for breeding of cruciferous vegetables to resist TuMV.

Keywords Chinese cabbage； Radish； Turnip mosaic virus； Phylogenetic evolution； Sequence analysis

蕪菁花葉病毒（TuMV）是馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）重要成員[1，2]，是僅有的侵染蕓薹屬（Brassica）植物的Potyvirus屬病毒。可侵染大白菜、蘿卜等十字花科蔬菜作物在內至少43科156屬300多種植物[3，4]，是蔬菜上僅次于黃瓜花葉病毒的第二大病毒[5，6]，可對蔬菜生產造成巨大損失。

傳統的株系（種群）劃分主要依賴于對鑒定寄主的侵染能力和癥狀反應，但這類劃分方法由于使用不同的鑒別寄主譜而表現出一定的局限性。近年來，隨著分子生物學技術的發展，生物信息學方法已大量應用于TuMV種群遺傳變異進化研究中，其中3′-UTR、CP及P1等基因均被用來進行株系劃分[7-9]。Ohshima等[10]和Tomimura等[11]用生物學與分子生物學相結合的方法，將來自世界各地的TuMV分離物劃分為2組寄主致病型：一種是BR寄主型，系統侵染蕓薹屬和蘿卜屬（Raphanus）植物；另一種是B寄主型，只系統侵染Brassica植物，而幾乎不侵染Raphanus植物。在系統關系中，這些分離物被進一步分為basal-B、basal-BR、Asian-BR和world-B組，而basal-B組中沒有中國分離物。Tian等[12]將中國的TuMV分離物分為3個組：Asian-BR、world-B和basal-BR組。本研究利用分子生物學手段，將采自山東、河南、遼寧、黑龍江及陜西等省份的大白菜、蘿卜疑似TuMV樣品進行了CP基因測序，研究其群體遺傳變異、株系變異與進化，確定歸屬地位，以期為十字花科蔬菜抗TuMV育種提供分子生物學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2015—2017年，分別于每年9—11月份于山東省濟南、青島、煙臺、棗莊、濰坊及河南省鞏義、原陽、遼寧省沈陽、黑龍江省哈爾濱、陜西省西安等地采集表現花葉、皺縮、植株矮化、畸形等癥狀的大白菜、蘿卜葉片樣品，-80℃冰箱中保存備用。采樣時，每個采樣點分別采集5～6個大白菜、蘿卜樣品，3年累計采集大白菜樣品243個，蘿卜樣品296個。每個檢出病毒序列命名按采樣時省、市（或縣級市，個別鎮）拼音縮寫（大寫）后加采集蔬菜種類英文縮寫前1～3個小寫字母（白菜c，蘿卜rad）、采樣序號，最后為年份。

RNA提取試劑盒、cDNA逆轉錄試劑盒，均購自東洋紡（上海）生物科技有限公司；Easy Taq（5 U/μL）、10 × Easy Taq Buffer、dNTPs（含Mg2+，2.5 mmol/L）、凝膠回收試劑盒、DNA分子量標準DL 2000 Plus，均購自北京全式金生物技術有限公司；其它常規化學藥劑均為分析純試劑。

1.2 試驗儀器

Centrifuge 5430R小型高速冷凍式離心機、Mastercycler nexus PCR儀（德國Eppendorf公司）；GelDoc-It 310 Imaging System凝膠成像系統（美國UVP公司）；JY 300電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）；AE224C電子分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 TuMV CP基因 RT-PCR擴增 RT-PCR的引物根據GenBank中報道的TuMV的CP基因序列，并參照莊木等[13]的報道設計合成。TuMV CP-F：5′-CAAGCAATCTTTGAGGATTAT G-3′；TuMV CP-R：5′-TATTTCCGATAAGCGAGAATA-3′，由生工生物工程（上海）有限公司合成。按照RNA提取試劑盒、cDNA逆轉錄試劑盒的操作步驟提取RNA并反轉錄獲得cDNA，以此為模板，進行PCR擴增，擴增條件：94℃ 2 min；94℃ 20 s，54℃ 30 s，72℃ 40 s，共35個循環；72℃ 10 min。反應結束后，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2 TuMV CP基因測序 利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段，提交測序公司進行測序。

1.3.3 系統進化分析和序列比對分析 借助DNAstar和BLAST軟件對獲得的各分離物CP序列進行核苷酸同源性分析，并選取NCBI上已發表的有代表性分離物CP基因序列做參照，用Mega 5.0構建系統進化樹，設Bootstrap 1 000重復進行各分支置信度分析。

2 結果與分析

2.1 TuMV的田間癥狀

田間調查發現，秋季大白菜、蘿卜等十字花科蔬菜上TuMV發生普遍，顯癥率一般在35%～65%，嚴重的達70%以上。主要表現為葉片皺縮、畸形、花葉、黃化、皰狀突起、脈間失綠、蕨葉、植株矮化等（圖1）。

2.2 各地樣品TuMV CP基因RT-PCR擴增

對采集的樣品進行RT-PCR分析，結果發現，陽性樣品均可擴增出986 bp的預期片段且無其它非特異性條帶（圖2），大白菜和蘿卜樣品陽性檢出率分別為67.6%和83.2%。

2.3 各地TuMV CP序列系統進化分析

經RT-PCR和測序分析共獲得214個TuMV CP序列。分別對獲得的大白菜、蘿卜部分分離物TuMV CP序列進行系統進化分析，用分屬于該病毒不同組的9個NCBI下載序列做參照，并以同屬馬鈴薯Y病毒屬成員的水仙黃條病毒（NYSV，AJ311372）為樹根（圖3）。系統進化樹顯示以下3個特點：各地大白菜、蘿卜TuMV CP序列分離物均屬于world-B和basal-BR組，而無Asian-BR和basal-B組的分離物；TuMV分離物歸屬首先是由侵染寄主決定的，其次是受地理位置的影響，即TuMV分離物歸屬既有寄主關聯性，又有地域性，寄主關聯性表現在大白菜TuMV CP分離物80%聚集于world-B組（圖3A），而蘿卜TuMV CP分離物93.67%聚集于basal-BR組（圖3B），TuMV的歸屬地域性表現在同一地點的大白菜間、蘿卜間樣品分離物在系統進化樹中集中成簇的現象較多；同一地點的大白菜間、蘿卜間TuMV分離物間既有一致性，但也存在多樣性。

2.4 各地TuMV CP基因核苷酸同源性分析

選擇13個采自代表性產區的TuMV分離物CP序列及分屬于該病毒不同組的6個NCBI下載序列，同屬于馬鈴薯Y病毒屬的水仙黃條病毒（NYSV，AJ311372）做參照，利用Megalign軟件對CP基因的核苷酸同源性進行分析。結果顯示，所選TuMv CP核苷酸序列同源性為88.3%～99.8%。屬于致病型basal-BR組的7個分離物之間和屬于world-B組的6個分離物之間的同源性較高，如basal-BR組內分離物間同源性為94.6%～99.8%，world-B組內分離物為95.3%～99.3%；而basal-BR與world-B致病型組間核苷酸同源性較低，為88.3%～91.6%。

3 討論與結論

分子變異是植物病毒種群（株系）遺傳變異并致使其生物學性狀及致病性變化的內在原因，植物病毒分子變異在基因組全序列上反映最為清楚，但由于全基因組測序需要花費大量的時間和資金，因而通常對病原的分子變異不是選擇整個基因組而是選擇其中的某個基因進行研究[14]。在Potyvirus屬病毒基因組中，CP和HC-Pro基因序列差異能充分反映病毒種類及株系間的分子變異[15]。因此本研究選擇CP基因作為TuMV種群變異的研究對象。

本研究對3年來采集自山東等五省市的大白菜、蘿卜的TuMV分離物CP基因進行分析，結果表明TuMV株系間存在廣泛的遺傳多樣性，尤其是不同寄主種類的TuMV分離物之間，且不同分離物之間存在重組現象（將另文報道）。

系統進化分析表明，所獲得的TuMV分離物均分屬于basal-BR組和world-B組，缺少basal-B組和Asian-BR組分離物。據報道，basal-B組的分離物一般來自于歐亞大陸的西南和中部的蕓薹或蕓薹屬植物，本研究獲得的分離物缺少basal-B組的成員，這與前人[12，16-18]的研究結果一致。中國TuMV分離物缺乏basal-B組，是地理位置的隔離還是寄主選擇性的結果，值得進一步探討。Asian-BR大多來源于東亞，特別是日本，寄主大多是蘿卜，本研究的214個大白菜、蘿卜分離物TuMV CP序列也缺少Asian-BR組的成員，這與李玲玲[16]、祝富祥等[18]的報道一致，但與張成玲[19]的研究結果不一致，這種差異可能是不同年份TuMV不同株系流行傳播分別承受著不同的選擇壓力造成的。Asian-BR組分離物在我國不占優勢，可能因為在我國多數地區的流行經受中性或負向選擇，在傳播中處于收縮狀態或平衡狀態，所以會隨不同年份出現此消彼長的現象。

basal-BR組和world-B組分離物在我國各地普遍流行發生，且大多數大白菜分離物TuMV CP序列屬于world-B，大多數蘿卜分離物TuMV CP序列屬于basal-BR，表明各地TuMV分離物歸屬存在明顯的寄主關聯性，同時與地理位置也有關，表現在同一地點的大白菜分離物間、蘿卜分離物間有較好的一致性，同時也存在一定的多樣性，這與TuMV種群自然流行的遺傳變異、傳播主要由傳毒介體蚜蟲完成有關。綜上所述，TuMV種群的遺傳變異是寄主適應、基因重組和地理分布等多因素綜合作用的結果。

參 考 文 獻：

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