三個品系蛋鴨β2m基因的克隆及多態性研究

張琳 于森 白俊平?┝侄?梅 楊少華 黃艷艷 吳家強 蔣萬春

摘要：為明確鴨主要組織相容性復合體Ⅰ（major histocompatibility complex， MHCⅠ）β微球蛋白（β2-microglobulin， β2m）分子的多態性和特征，推進相關免疫研究，本試驗對我國3個地方品系蛋鴨的多條β2m基因進行克隆，序列經特征分析、同源比對和遺傳進化分析后，進行了高變異位點的計算，并將重要變異位點在3D結構上進行了定位。結果表明，鴨β2m基因高度保守，僅個別堿基發生突變，序列中半胱氨酸、免疫球蛋白超基因家族的特征基序“YxCxVxH”和與重鏈相互作用的位點均保守性存在；篩選的47條β2m氨基酸序列同源性為95%～100%，完全一致序列普遍存在；鴨β2m氨基酸序列與雞同源性最高，與魚類和兩棲類最低，結果與遺傳進化分析相一致；成熟肽中高變異位點和與重鏈相互作用的變異位點多位于β折疊上，但不會對β2m的功能產生影響。綜合來看，鴨β2m基因保守性高，僅存在一種類型，與MHCⅠ重鏈的作用方式也相對固定。本試驗結果有助于深入理解鴨β2m的分子特性，推動MHCⅠ相關免疫研究的開展。

關鍵詞：鴨；主要組織相容性復合體（MHCⅠ）；β微球蛋白（β2m）；多態性

中圖分類號：S834：Q78 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2018）08-0142-06

Cloning and Molecular Polymorphism of β2m

Gene from Three Laying Duck Lines

Zhang Lin1， Yu Sen1*， Bai Junping1，2， Lin Dongmei2， Yang Shaohua1，

Huang Yanyan1， Wu Jiaqiang1， Jiang Wanchun2

（1. Institute of Animal Science and Veterinary Medicine， Shandong Academy of Agricultural Sciences/

Shandong Key Laboratory of Animal Disease Control and Breeding， Jinan 250100， China；

2. College of Life Sciences and Food Engineering， Hebei University of Engineering， Handan 056021， China）

Abstract In order to clarify the polymorphism and characteristics of β2-microglobulin （β2m） gene， a major histocompatibility complexⅠ （MHCⅠ） in ducks and promote related immune research， representative β2m genes from three local laying ducks in China were cloned. Subsequently， their sequences were analyzed through multiple sequence alignment， homologous comparison and phylogenetic tree method. The highly variable residue sites （HVSs） were estimated by Wu-kabat variability index， as well as key variable sites， then their location on reported crystal structure model were studied. As a result， duck β2m genes were highly conserved with little mutant bases. The two cysteines，the Ig feature motif YxCxVxH and the interactive residues between heavy and light chains were all highly conserved. The amino acid homology among 47 screened duck β2m sequences ranged from 95%～100% and identical sequences were ubiquitous. Duck β2m shared the highest homology with chicken， and the lowest with fish and amphibian， which was consistent with the results of genetic evolution analysis. Most of HVSs and mutant residues interacted with heavy chain of MHCⅠ molecule were mainly located on β-strand， but they would not affect the structure of β2m and the interaction with heavy chains. These results showed that there was only one type β2m in ducks with high conservatism and the interaction with heavy chain were stationary. The results would give us a better understanding for duck β2m and promote further immune research of MHCⅠ.

Keywords Laying duck； Major histocompatibility complex （MHC Ⅰ）； β2-microglobulin （β2m）； Polymorphism

主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex， MHC）是編碼與免疫應答直接相關且具有高度多態性的基因群，作為肽受體服務于免疫系統[1]。其中MHCⅠ分子在抵抗病原感染的免疫反應中起關鍵作用[2]。MHCⅠ分子分為重鏈和輕鏈兩部分，重鏈由MHCⅠ類基因編碼，而輕鏈則由位于另一條染色體上的β2m基因編碼。β2m以非共價的方式與重鏈結合并定位于有核細胞膜上，對于維持MHCⅠ類分子的正確折疊和構型的穩定不可或缺[3]。同時β2m對于MHCⅠ-肽復合體的組裝起關鍵作用，也只有在其存在的情況下，MHCⅠ才能與抗原肽結合形成三分子復合物，并被CD8+T細胞上的T細胞抗原受體（TCR）特異性識別，從而誘導細胞免疫反應的發生[4]。相對于MHCⅠ重鏈基因由多個基因座的不同等位基因表達而形成高度多態性，β2m基因往往不具備多態性或者只呈現出有限的多態性：人的β2m僅由一個基因編碼，不具有多態性；哺乳動物的β2m也是由單個基因編碼，但存在多個等位基因，表現出有限的多態性[5-7]。然而在低等脊椎動物硬骨魚中的情況則不同，虹鱒、鱘魚、斑馬魚和草魚等多由不同基因座上的等位基因表達兩種類型的β2m分子，功能上也可能存在差異[8-10]。禽類的進化地位處于魚類與哺乳動物之間，雞的β2m表現出一定的多態性，依據同源性可劃分為兩類，同時可能存在新的等位基因[11]。作為親緣關系較近的鴨，其β2m是否也存在不同的等位基因，基因多態性的程度如何均未見報道。本研究擬克隆3個品系鴨的β2m基因并進行多態性分析，然后利用同源模建對變異位點在三維結構上進行定位，以明確鴨β2m的多態性及其對結構和功能的影響，以期為β2m免疫作用機理的進一步研究提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

從5個鴨場購買了我國3個蛋鴨品種的鴨38只，其中24只紹興鴨來自3個不同地區的鴨場，每個鴨場8只，分別命名為SX、SB、SD；金定鴨（JD）和微山麻鴨（WS）各7只，同一品種來自同一鴨場。所有鴨飼養至12周齡時剖取脾臟，用于總RNA的提取。

RNAiso Plus、Ex Taq、pMD18T克隆載體購自寶生物工程（大連）有限公司；DH5α感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司；質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒等購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取、cDNA 合成和β2m基因的PCR擴增 剖取鴨新鮮脾臟，Trizol法提取總RNA，并利用隨機引物反轉錄成第一鏈cDNA。設計鴨β2m基因特異性引物P1（5′-ATGGCCAAGGCGGCGATCGTGG-3′）、P2（5′-TTAGAAGTCTGGCTCCCATCTGAAGGACTG-3′），進行編碼區序列的PCR擴增。反應體系為：10×Ex Taq buffer 5 μL，P1/ P2（10 μmol/L ）各1 μL，cDNA模板 0.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，Ex Taq酶 0.5 μL，ddH2O補足50 μL。反應條件為：98℃預變性5 min；94℃變性30 s，68℃退火30 s，72℃延伸30 s，32個循環；72℃延伸10 min；4℃保存。經瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，回收目的序列，連入pMD18T載體，轉化大腸桿菌DH5α。每個樣品條帶挑取3個單克隆菌落進行鑒定，陽性質粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。對于陽性序列，均進行兩次平行的PCR驗證，方作為有效序列。

1.2.2 序列分析和進化樹的構建 利用DNAMAN、GENETYX和Jalview軟件進行序列分析，采用ClustalW和Jalview軟件進行序列比對。在對β2m胞外區核苷酸序列進行比對的基礎上，利用MEGA6構建系統進化樹[12]。

1.2.3 變異位點在鴨β2m結構上的定位 在PVS服務器上（http：//imed.med. ucm.es/ PVS/）對β2m成熟區氨基酸變異頻率進行計算，利用Wu-Kabat計算方法[13]，將指數≥4.0的位點認定為高變異位點（HVS），同時將其與MHCⅠ重鏈相作用的變異位點在3D結構上進行定位，相關操作使用PyMOL軟件完成。模建所用結構為Anpl-UAA*01 （PDB： 5GJX）。

2 結果與分析

2.1 β2m基因擴增與基本特征分析

從38只試驗鴨中共克隆得到典型β2m基因93條，其中SX中分離15條、SB 21條、SD 19條、JD 20條、WS 18條。經比對發現，各品系中分離得到的β2m基因核苷酸同源性較高，完全一致的序列普遍存在。將各品系中完全相同的序列僅保留1條后，3品系鴨共得到序列47條（SX 13條、SB 12條、SD 12條、JD 5條、WS 5條）。對47條序列進行分析發現，所有序列編碼區長360 bp，編碼119個氨基酸，其中5′端18個氨基酸為信號肽，之后101個氨基酸為成熟肽。如圖1所示，成熟肽序列較為保守，變異位點少且較為分散；在第27 位和82位為保守的半胱氨酸（C），可形成一對二硫鍵，連接兩個β片層。在第82 位半胱氨酸附近存在保守的“YTCRVDH”序列，符合免疫球蛋白超基因家族的特征基序“YxCxVxH”（x代表任一氨基酸）[11]；在與MHCⅠ分子重鏈相互作用的12個氨基酸中，除第2位（P2）和第10位（P10）谷氨酰胺（glutanine， Q）發生變異外，其余位點均高度保守。

2.2 序列同源性分析

對獲得的47條β2m成熟區氨基酸序列進行同源性分析發現，同源性在95%～100%之間。按照品系來看，紹興鴨的同源性為96%～100%，金定鴨為96%～100%，微山麻鴨為98%～100%，序列保守性均較高。雖然各品系中核苷酸完全相同的β2m序列只選擇了一條，但推導的成熟區氨基酸序列相一致的比例仍然很高，有18條，占序列總數的38.30%，其中金定鴨中有2條（占比40.00%），微山麻鴨為3條（占比60.00%），紹興鴨中SX、SB、SD分別為4條（占比30.77%）、6條（占比50.00%）和3條（占比25.00%）。以上結果表明，鴨的β2m序列高度保守，成熟肽一致的序列在不同品系中普遍存在；氨基酸的突變為隨機的點突變，替換率在不同群體中不一致。

將鴨β2m成熟肽與人（M30682）、鼠（X01838）、豬（FJ944026）、羊（EF489536）、牛（NM_173893）、猴（AY445834）、雞（M84767）、魚（AB128864）和蛙（AF217962）的相應序列進行同源性比對，發現鴨與雞的同源性最高，為60.4%；與魚類、兩棲類蛙的同源性最低，分別為44.9%和32.0%；而與人類、哺乳動物的同源性介于47.5%～51.0%之間。

2.3 進化樹的構建

對同源性低于98.0%的鴨β2m成熟肽序列和人、雞、魚、蛙和其他哺乳動物的序列構建了系統進化樹。圖2所示，雞與鴨的親緣關系最近，處于同一分支，應為同一祖先進化而來，魚類和兩棲類動物與之遺傳距離最遠。

2.4 變異位點在3D結構上的定位

如圖3所示，β2m分子共存在2個HVS，分別位于P39和P64。隨后將高變異位點和與MHCⅠ重鏈相互作用的變異位點在鴨β2m的3D結構上進行了定位（圖4），發現2個HVS（紅色標注）雖位于兩個β片層的折疊上，但并不是與重鏈相互作用的關鍵位點。而與重鏈作用的變異位點P2（Q→L）位于loop上，P10（Q→E）則位于A折疊上。

3 討論與結論

本研究中共獲得93條有效的β2m基因序列，核苷酸序列比對后發現有近50%的序列完全一致，而剩余47條成熟肽氨基酸序列的同源性為95%～100%，且同源性為100%的序列共有18條，變異以點突變為主且較為隨機，表明鴨β2m基因高度保守。對氨基酸序列的進一步分析發現，鴨β2m具有典型的免疫球蛋白超基因家族的特征基序“YxCxVxH”，形成二硫鍵的半胱氨酸保守存在，與重鏈相互作用的12個氨基酸也高度保守（序列發生P2和P10的氨基酸替換）。所以，鴨β2m與高等脊椎動物的β2m基因一樣十分保守，不存在不同類型。雖然分離得到的β2m基因數量有限，但至少能夠反映鴨β2m存在不同類型的概率極低。

動物不同品系往往表達不同的基因類型。早先的研究表明，雞β2m是由單個基因編碼的單一蛋白，高度保守，不存在多態性[14，15]。但2005年，Yan等[11]在我國3個地方品系雞中發現了新的β2m等位基因。本研究中，我們同時選擇了3個地方品系的鴨（其中包括不同環境飼養的3種紹興鴨）進行β2m的擴增，但并未發現新的基因群或等位基因，且3個品種中均分離到完全一致的序列，可見鴨品系的不同對β2m基因的影響不大，即使生存環境壓力使MHCⅠ分子的重鏈進化產生高度多態特性（結果另文發表）。

雖然鴨β2m基因高度保守，相同基因的覆蓋率也很高，但對其氨基酸進行變異位點分析仍發現兩個高變異位點。P39和P64位于β折疊股上，但兩位點并不參與與重鏈的相互作用，對于β2m功能的影響并不明顯。此外，在與重鏈相互作用的12個位點中，也有2個位點的氨基酸發生了替換。為了明確變異對功能的影響，我們也對其在3D結構上進行了定位和分析，P2位于loop上，其C端與重鏈Lys117形成一個氫鍵，而N端則處于游離狀態[16]，所以由Gln突變為Leu不會影響其結構與功能的變化；P10位于β折疊股上，其C端與重鏈Trp240、Pro231兩氨基酸各形成一個氫鍵[16]，但Gln和Glu均為芳香族酸性氨基酸，結構組成相似，故突變同樣對結構的影響不大。此外，鴨只表達一種MHCⅠ基因，但具有高度的多態性，有利于多肽的結合和對疾病的抵抗[17]。而其分子中與β2m相互作用的位點卻相當保守，對應的β2m上12個作用位點也高度一致，這就決定了鴨MHCⅠ重鏈與輕鏈之間的作用方式僅有此一種。

將鴨β2m與其他物種β2m 的氨基酸序列進行同源比對發現，鴨與雞的同源性最高（60.4%），而與魚類、兩棲類蛙的同源性最低（44.9%和32.0%），與人和哺乳動物的同源性居中，這也與進化樹所反映的進化關系相吻合，即位于哺乳動物和魚類之間。從進化角度來說，鴨β2m基因的保守性高，不具有多態性，此特點更接近于哺乳動物；但同時鴨β2m與重鏈的相互作用面積是目前已知動物中最大的，且相互之間的結合鍵也是最多的[16]，這也使得MHCⅠ分子在多肽不存在的情況下形成功能復合體，這表明鴨MHCⅠ向著結構更為穩固的方向在進化，此特點又與低等脊椎動物免疫球蛋白超基因家族（IgSF）的特點類似[18]。所以我們推測，鴨β2m很有可能是魚類β2m向哺乳動物β2m進化的重要過渡分子。

本研究對3個品系鴨中擴增的β2m基因進行了多態性和特征分析，發現鴨β2m僅有一種類型且高度保守，高變異位點和與重鏈相互作用關鍵位點的突變不會對其功能產生影響。研究結果明確了鴨β2m的保守性，為后續相關免疫研究的開展提供了基礎資料。

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