楊靜華：探索生命編碼的秘密

本刊記者 劉 佳

在蒙特利爾大學——結緣RNA生命起源學說

楊靜華最早師從于著名的分子進化學家、蒙特利爾大學Bob Cedergren教授，從事催化核糖核酸（ribozyme）結構和功能的研究。1988年在Cedergren教授的推薦下認識了著名諾貝爾獎得主、哈佛大學Walter Gilbert教授，第一次了解到RNA生命起源學說并開始研究生命的編碼過程。

楊靜華介紹說，R N A生命起源學說的代表作是分子生物學先驅James Watson的專著The RNA World，其主要論點描述了從甲烷、碳、氫、氧、氮等還原性無機世界，過渡到含有生命組成單元核糖核苷、氨基酸等的原始有機世界，最后形成具有自身復制特征的雙鏈RNA世界，完成了生命的最早編碼過程。作為RNA生命起源的關鍵證據，是RNA可以完成自身復制所必須的催化功能。楊靜華在Cedergren教授的指導下，完全用化學合成的方法制造了具有生物催化功能的RNA以及RNA/DNA的混合多聚物，發表了多篇重要論文，在此基礎上提出了脫氧核糖酶或nucleozyme的概念并獲得一系列美國專利（US5652094/6140491/6713456），完善了RNA生命起源學說。

在博士研究期間，楊靜華積極組織和宣傳近代史上中國同行在tRNA化學合成方面對人類進化領域的卓越貢獻。20世紀六七十年代，中國舉全國之力完成了tRNA全化學合成，這是人類進化史上最精彩的一段歷史事實，特別是發生在西方宗教神學針對科學進化論的激烈博弈，要拿出“生命可以由無機分子化學合成”證據的時代，本來應該被西方進化學界熱捧的重大事件，但由于“文化大革命”等特殊原因卻很少被西方人提起。在楊靜華的建議下，Cedergren教授特別邀請了中國遺傳泰斗談家楨夫婦訪問加拿大，由楊靜華陪同走訪了眾多分子進化領域同行，進行了多場次演講，向西方介紹了中國在那段特殊時期“tRNA大會戰”的原因和中國同行對人類進化理論的卓越貢獻，特別是毛澤東主席在遺傳學領域拋棄當時蘇聯李森科主義而選擇接受西方的孟德爾學說的歷史背景。

在1992年獲得加拿大醫學研究總署杰出青年獎的授獎儀式上

楊靜華相信，生命現象的基礎一定遵循熱力學定律，他相信在探索生命現象的邏輯基礎的時候，常常會發現生命科學中的一些無法解釋的原始問題，而這些原始問題的答案往往具有重大的理論和現實意義。

在哈佛醫學院——探尋RNA功能的演化

值得強調的是，人類作為現代生物的代表卻是以蛋白質作為催化功能的，并沒有看到RNA的催化作用。如果RNA起源學說是對的話，在現代生物體系應該可以找到原始RNA的催化作用。的確，1989年科羅拉多大學Tom Cech教授和耶魯大學的Sid Altman教授，也都是鮑勃的好朋友，分別證明了tRNA和rRNA成熟過程由RNA催化，由此獲得了諾貝爾化學獎。但是問題并沒有得到滿意的回答，在生命過程中最重要的信使核糖核酸(mRNA)中，卻遲遲找不到催化RNA的蹤影。

為了回答這個問題，楊靜華在1992年拿到博士學位以后來到了哈佛醫學院Bernado Nadal-Ginard教授實驗室繼續博士后的研究。經過深入研究以后，楊靜華提出了由核小RNA U6/U4組成的復合體在mRNA成熟過程中起著催化作用的假說并拿出了有力證據，結果以第一作者發表在《科學》雜志上（Science 263:77,1994），從而確立了RNA在人類進化早期的催化功能，為RNA生命起源學說畫上了完美的句號。

在哈佛大學——開啟RNA編輯理論研究

然而，RNA生命起源學說與現代生命的細胞現狀還是具有很大差距。盡管低等生物中確實存在大量進化初期負責編碼的雙鏈RNA，但哺乳類動物——至少人類細胞內沒有發現雙鏈RNA的存在。這是RNA生命起源學說的一個待解之謎，也是楊靜華研究生涯中的下一個目標。

1994年，經過激烈競爭，楊靜華來到了世界著名生物學家、哈佛大學細胞生物學系教授Tom Maniatis的實驗室做研究員(Research Associate)。Tom是分子生物學領域的先驅，是DNA雙螺旋發現者James Watson的弟子，著作有《分子克隆》，被譽為分子生物學的圣經，國內外分子生物學領域學生無人不知的工具書。來到實驗室的第一天，Tom和他的鐵搭檔——也是楊靜華的第二導師、2015年諾貝爾獎得主Richard Axel教授，甩給楊靜華一個神經生物學中的難題，說“now it’s your problem（現在就是你的事了）”就離開了。

楊靜華回憶說，導師提出的問題是這樣的：人類DNA編碼谷氨酸受體和實際測到cDNA序列總是不一樣，基因編碼的是腺嘌呤，而每次測到的卻是鳥嘌呤。這個變化就像是一個開關，決定著人類谷氨酸受體的“開”或“關”。經過仔細研究，楊靜華設計了一個巧妙的RNA鏈接方案，把可能變化的腺嘌呤標記上了同位素，通過實驗解決了這一難題。

楊靜華的研究表明，哺乳動物細胞中都存在著一種未報道過的生物活性，能夠非常有效地把雙鏈RNA中的腺嘌呤通過脫氨反應變成次黃嘌呤。這個重要結果發表在《自然》雜志上（Nature 374:77,1995）。現在，這個過程已經被定義為“RNA編輯”過程（RNA editing）。很快，楊靜華克隆并測定了催化這個過程的酶，現在被定義為RNA編輯酶（ADAR1/2/3）。現在我們知道，RNA編輯廣泛存在于真核生物細胞中，是RNA轉錄以后對基因編碼進一步調控的重要生物環節，已經成為一個嶄新的研究領域。

與導師Tom Maniatis合影

天道酬勤，這個ADAR1編輯酶正是楊靜華苦苦尋找的關于RNA生命起源之謎的正確答案。現在我們知道，正是由于雙鏈RNA編輯酶的存在，哺乳動物細胞雙鏈RNA中的腺嘌呤被編輯，使得雙鏈RNA結構被拆開，形成了次黃嘌呤RNA。所以，雙鏈RNA編輯酶的發現解釋了為什么哺乳動物細胞中檢測不到雙鏈RNA的重大疑問。現代基因組學研究表明，現代生物包括哺乳動物等高等生物基因組中編碼了大量雙鏈RNA，是RNA起源學說中原始生命形式的“活化石”，在現代植物、昆蟲、病毒等高低等生物中仍然廣泛存在。所以，雙鏈RNA編輯酶的發現也是對RNA生命起源學說的有力支持。

在耶魯大學——揭秘雙鏈RNA和“黑色物質”

楊靜華在雙鏈RNA編輯領域的研究成果進一步演化為RNA生命起源學說中的另一個難題：既然哺乳動物包括人類基因組編碼大量雙鏈RNA基因，在雙鏈RNA編輯酶的作用下轉為次黃嘌呤RNA，那么為什么現代哺乳動物中并沒有發現大量的次黃嘌呤RNA？為此，生命科學領域同行常常把雙鏈RNA和次黃嘌呤RNA稱為哺乳動物中的“黑色物質”。

1998年，楊靜華從上百個申請者中得到了耶魯大學醫學院獨立研究員和Assistant Professor的職位，擁有了自己獨立的實驗室，先后獲得了美國國立衛生院NIH RO1研究基金、NIH KO2獨立職業發展基金，以及SusuanG Koman基金會乳腺癌研究基金的支持，成為耶魯大學癌癥中心的研究員。在此期間，楊靜華領導的團隊針對人類雙鏈RNA進行了深入研究，發表了一系列高水平研究論文，成為“黑色物質”研究領域的學術帶頭人。

楊靜華領導的研究團隊證明哺乳動物細胞中廣泛存在雙鏈RNA編輯酶，弄清楚了雙鏈RNA編輯酶的蛋白質功能結構、細胞核內外分布、表達轉運機制以及雙鏈RNA的加工、調控和信號轉導等。值得強調的是，哺乳動物雙鏈RNA編輯酶受到外界刺激過程中出現急劇應激反應，特別是受到病毒感染的時候表達急劇增加，說明雙鏈RNA信號在抗病毒過程中的重要作用。

研究結果與預測的完全一致，楊靜華研究團隊進一步證實了哺乳動物細胞在感染條件下不但產生了大量的次黃嘌呤RNA，而且主要產生在編碼蛋白質的信使RNA（mRNA）中，反而在核糖體RNA(rRNA)和核內小RNA(snoRNA)很少存在。次黃嘌呤RNA聚集在細胞核中轉錄活躍的核小體區域。這個結果又一次證實雙鏈RNA確實表達了，但是被定量地轉換成次黃嘌呤RNA了。

楊靜華進一步解釋說，從RNA生命起源學說的角度上來講，低等生物和高等生物在進化過程中對原始雙鏈RNA的遺傳功能做了不同的選擇。很多低等生物，特別是病毒仍然以雙鏈RNA作為遺傳物質或成為DNA復制的中間體。相反，在哺乳動物細胞中，人類雙鏈RNA的遺傳功能已經完全被DNA取代，而且雙鏈RNA的表達被雙鏈RNA編輯酶嚴格控制，正常情況下檢測不到雙鏈RNA的表達。現在我們找到，正是利用這個差別，哺乳動物細胞通過識別雙鏈RNA來感知是否被低等生物侵犯。

楊靜華感慨地說，經過進化選擇，作為最早生命形式的雙鏈RNA變成了哺乳動物細胞遭受低等生物侵犯的危險信號，說明生命形式的多樣性和可塑性。生命可以由一種形式轉化為另外一種形式。

在波士頓大學——迎接雙鏈RNA帶來的挑戰

2006年，楊靜華獲得波士頓大學副教授的位置，出任VA醫學中心腫瘤外科研究室和臨床蛋白質組實驗室主任。同時，在探索生命編碼秘密的道路上，他也面臨更嚴峻的挑戰。

楊靜華在雙鏈RNA方面的研究成果給生命科學帶來了進一步的挑戰。首先，為什么在人類基因組和轉錄組研究中并沒有發現次黃嘌呤—RNA對應cDNA信息？其次，為什么人類蛋白組中并沒有由次黃嘌呤RNA帶來的非基因編碼氨基酸序列？

每當理論與現實產生分歧的時候，往往意味著存在新突破的機會。

2016年楊靜華在波士頓大學的研究團隊參加會議時與Azadzoi教授（左4）合影

楊靜華說，既然人類轉錄組中沒有發現大量的次黃嘌呤信使RNA，說明人們在認識基因組（DNA）到轉錄組（cDNA)的過程中存在漏洞。在現代生物技術中，DNA序列可以直接分析，但是RNA的序列必須經過反轉錄成cDNA再經過測序的。也就是說，人們并沒有直接測定過真正轉錄出來的RNA，當然也沒有測定過次黃嘌呤RNA的序列。

在波士頓大學期間，楊靜華領導的團隊發現，反轉錄酶在通常情況下并不能有效地識別RNA中的次黃嘌呤。經過測量，正常情況下反轉錄酶通過次黃嘌呤的效率下降3個數量級。所以當RNA序列中含有多個次黃嘌呤的時候，反轉錄全長RNA的幾率幾乎忽略不計。所以，這就解釋了為什么現代測序技術不能正確地反映次黃嘌呤RNA的存在。為了徹底回答揭示哺乳動物中的“黑色物質”，楊靜華解釋道，必須找到或人為制造一種可以識別次黃嘌呤的反轉錄酶突變體，這樣就能直接研究人類體內這些看不見的遺傳物質了。

對人類進化來講，雙鏈RNA已經進化成為人類必須時時刻刻應對的危險信號。楊靜華解釋說，低等生物特別是病毒仍然依賴原始的雙鏈RNA作為它們賴以生存的生命特征，人類早已經把雙鏈RNA作為病毒侵犯的直接證據，通常當作治病相關分子特征（pathogen associated molecular pattern, PAMP）。

根據這個特征，楊靜華提出了一種廣譜抗病毒理念并設計了一種抵抗病毒感染的“雙鏈RNA依賴型自殺多肽”(dsRNA-dependent caspase recruiter, dsCARE)。這個dsCARE對各式各樣的病毒感染，包括類薩斯病毒、禽流感病毒，口蹄疫病毒，甚至是死亡率極高的埃博拉病毒都有百分之百的抵抗作用，特別適用于預防那些突發性、高變異性和新型未知病毒感染（FASEB 25:1767, 2011；JVI 87:5384,2013;SciRep 6:22550, 2015）。毫無疑問，針對dsCARE進一步研究，有利于廣譜抗病毒疫苗的開發，其最終產物特別適用于類似薩斯那樣完全未知或尚未鑒定的病毒爆發情況下，對醫務人員和高危險人群提供有效防護。

熵的“意識”——雙鏈RNA的熱力學研究

雙鏈RNA的研究為楊靜華打開了探索生命秘密的大門，更進一步演化到對人類意識形態的思考。從雙鏈RNA作為最早的生命形式，到雙鏈RNA作為人類細胞的危險信號，再到雙鏈RNA為基礎的廣譜抗病毒理論，真正讓楊靜華困惑的卻是現代人意識的形成和分子進化基礎。既然意識也是生命的一部分，但又不像雙鏈RNA那樣具有可觀察的物理特性。那么，現代人類意識的生物化學基礎是什么？人類細胞對雙鏈RNA原始生命體的棄舍是不是就是在分子水平的生物意識？

于是，楊靜華提出了一個針對RNA生命起源學說具有挑戰性的假設，即雙鏈RNA作為原始生命形式應該具備生物意識的基本元素。假設在地球早期環境的RNA時期，一團RNA可以完成自我復制形成多個RNA子代，其過程一定遵循熱力學定律。那么，這團具有生命特征的雙鏈RNA和生成它之前的化學成分相比，就是一個特殊的能量狀態E=ΔH+ΔS。雙鏈RNA的化學能量狀態ΔH應該對應于生命體的復制，雙鏈RNA的熵能ΔS應該對應于生命體形成的意識狀態。

通過對RNA生命起源的深入研究，楊靜華認為，雙鏈RNA復制過程的熵變是原始生物生存意識的基本單元。按熱力學第二定律，自發過程一定是熵增過程，說明雙鏈RNA這個生命體就具有一種復制生命的天然傾向或“生存意識”，而生存意識正是現代復雜生命體意識形態背后的基本元素。按照這個假設推斷，復雜生命的意識應該是整個生物體熵的集合，是各個器官、組織和細胞中的每個生物化學過程熵的集中反映和意識疊加。

和學生們合影

對于意識和熵的關系還需要進行進一步的驗證。如何設計和測定雙鏈RNA復制過程的熵變，進一步解析熵的意識屬性和疊加規則是證實復雜意識的關鍵，也是解釋人類意識的本質和制造具有自我意識人工智能的理論基礎。

回國——率先提出非編碼氨基酸概念

應該指出，RNA生命起源學說揭示了生命遺傳物質的非唯一性。特別是雙鏈RNA編輯的發現給生命科學帶來了一個更加嚴肅的問題，基因編碼蛋白質的可靠性。既然基因翻譯過程中經過了RNA編輯，那么真正人類體內的蛋白質與基因編碼的蛋白質序列應該存在很大差異。加上人類體內具有各種非標準氨基酸和蛋白質翻譯后修飾，可以想象，真正天然蛋白質和基因編碼蛋白質應該存在很大差別。但是，楊靜華解釋說，由于蛋白質測序技術的限制，人們還不能大規模地測定蛋白組的序列。事實上，基因庫所收集的蛋白質序列基本上是對DNA序列的理論翻譯。更廣泛地說，人們并不知道基因編碼的蛋白質序列在多大程度上反映了真實的人類蛋白質？

為了研究真實的蛋白質，楊靜華首先提出了“非編碼氨基酸”的概念，即把天然蛋白質中任何與基因理論編碼不一樣的氨基酸殘基定義為非編碼氨基酸（non-coded amino acids, ncAAs）。楊靜華決心利用蛋白質質譜技術解開非編碼氨基酸之謎。

在導師Tom Maniatis60歲生日的師生聚會上

其實，從1995年開始，還在哈佛大學Tom Maniatis實驗室做博士后的時候，楊靜華就使用了質譜蛋白質測定技術并確立了RNA編輯酶的序列（PNAS 94:4354,1997）。在耶魯大學期間，他繼續關注質譜蛋白質測定技術并且又確定了RNA編輯酶復合物中多個蛋白質的序列。2006年到了波士頓大學以后，楊靜華獲得了兩臺蛋白質譜設備專項基金的支持，創建了臨床蛋白組實驗室并兼任主任。在廣譜抗病毒理論研究受到嚴重干擾的時侯，楊靜華毅然邁向了挑戰非編碼氨基酸這個嶄新的領域。但是由于需要大量人類疾病組織樣本，這個項目在波士頓大學進展得非常緩慢。

2012年，為了解決人類疾病樣本資源的困難，楊靜華以特聘教授并兼任山東大學癌癥研究中心主任的身份，與山東大學展開了緊密合作。在楊靜華的領導下，他的研究團隊攻克了一個又一個技術難關，解決了準確測定非編碼氨基酸的技術難題。結果表明，人類精子蛋白組中至少存在600多種非編碼氨基酸，分布在將近4萬個蛋白位點上，大部分從未報道過。這個結果超出了人們的想象，說明真實的蛋白質氨基酸序列和DNA編碼的理論蛋白質氨基酸序列存在很大差別，也說明真實蛋白質序列的多樣性。和單核苷酸多樣性相比，蛋白質氨基酸多樣性更直接地影響著蛋白質的功能，更可能參與生理病理過程，更有望成為藥物靶向和疾病標記物。可以說，繼基因水平上的單核苷酸多樣性，人類蛋白組非編碼氨基酸的大規模測定技術將在蛋白質水平上的精準醫療領域發揮關鍵作用。

目前，在非編碼氨基酸大規模測定技術方面，楊靜華團隊已經申請了超過20多項發明專利，其中多項已經獲得了國際專利。

任重道遠——助力人類重大疾病的精準醫療

研究生命起源不是目的，楊靜華解釋說，揭示生命奧秘的最終目標是造福于人類健康。

2017年，鄭州大學第一附屬醫院特別邀請楊靜華成立了一個臨床系統生物學研究中心，目標是建立一個大規模測定人類重大疾病非編碼氨基酸的質譜平臺和一個世界一流的人類重大疾病組織樣本庫。通過與臨床一線醫生的緊密合作，針對臨床治療中的具體問題，建立疾病相關非編碼氨基酸數據庫，開發相關精準醫療檢測技術。

楊靜華解釋說，以蛋白組氨基酸多樣性為基礎的蛋白檢測技術為精準醫療開辟了更準確的醫療途徑，使精準醫療從基因組水平過度到了蛋白組水平。所以，研究和開發針對人類常見和重大疾病的蛋白檢測技術，具有深遠的理論意義和更大的市場價值。楊靜華的長期目標就是建立和完善人類重大疾病相關非編碼氨基酸數據庫，在蛋白水平上揭示人類重大疾病的致病機制，開發以蛋白質多樣性為基礎的精準醫療技術。

可以預見，隨著人類疾病相關非標準氨基酸數據的完善，蛋白組氨基酸多樣性將在人類重大疾病的診斷、預后、用藥、治療等方面產生深遠的影響，成為精準醫療的重要組成部分。所以，以蛋白組氨基酸多樣性為核心，研究和開發人類重大疾病相關的非編碼氨基酸及其蛋白檢測技術，將帶動國內外精準醫療市場的全面發展，有望成為精準醫療領域具有獨立知識產權的引領企業。

任重道遠，楊靜華表示要盡力早日實現這個目標！