細鱗魚嗜水氣單胞菌LAMP快速檢測方法的建立

郭玉丹 杜迎春 何亞鵬 時 曉 賈 斌

（1.石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832003；2.北京市水生野生動植物救護中心，北京 102101）

細鱗魚（Brachymystax lenok）屬鮭形目，鮭科，細鱗魚屬，是我國名貴的陸封型冷水魚。1988年，細鱗魚被列入國家二級保護野生動物名錄。近年來野生細鱗魚分布范圍逐漸縮小，野生種群急劇衰退，北京已經瀕臨滅絕。

為了恢復細鱗魚這一珍稀的瀕危物種，人們陸續開展了細鱗魚的馴養、繁育及增殖放流工作，并取得了初步的成功。但在細鱗魚的人工馴養過程中，各種疾病頻發，尤其是各類細菌性疾病高發，一旦發病很難根治，經常會造成毀滅性后果，造成嚴重經濟損失。因此，在馴養繁育中，迫切需要一種快捷、簡便的方法對病源菌進行準確、快速的診斷，對疫病進行早期預防和治療。

本研究的目的就是將LAMP技術應用到細鱗魚細菌性疾病的診斷中來，建立一種快速、準確、高效的檢測方法。

1 試驗材料

1.1 菌株 嗜水氣單胞菌,由北京市水生野生動植物救護中心分離培養。

1.2 試驗儀器 PCR擴增儀（上海依科賽生物制品有限公司），超凈工作臺（蘇州尚田潔凈技術有限公司），凝膠成像儀（上海依科賽生物制品有限公司），超純水系統（優普）1.3 試驗試劑 細菌微量生化鑒定管（北京陸橋技術股份有限公司），藥敏紙片（北京天壇藥物生物技術開發有限公司），BstDNA鏈置換聚合酶及緩沖液Buffer（美國紐英倫生物技術），細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司出品），SYBER Green I核酸染料（北京百泰克生物技術有限公司）。

2 試驗方法

2.1 細菌DNA的提取 利用天根生化科技有限公司生產的細菌基因組DNA提取試劑盒，對待測菌株的新鮮純培養液進行細菌總DNA 提取（按說明書操作）。

2.2 LAMP引物的設計合成 NCBI上公布的嗜水氣單胞菌pilin基因序列設計引物，利用在線引物設計軟件Primer Explorer V4（http://primerexplorer.jp/e/）設計完成（表1）。設計好的引物提交華大公司進行合成。

2.3 LAMP反應體系的建立 外引物的反應濃度為5 pmol，內引物的濃度為40 pmol，環引物的濃度為40 pmol。緩沖液的濃度為2.5 mol/L,鎂離子的濃度為150 mmol/L，dNTP的濃度為10 mmol/L，BstDNA鏈置換聚合酶的濃度為8 U，模板為2 μL，補加去離子水至25 μL（表2）。63.5 ℃水浴鍋孵育，然后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 嗜水氣單胞菌（Ah-1）LAMP引物序列

表2 LAMP方法的反應體系

2.4 LAMP反應的特異性分析 利用設計合成的LAMP引物為模板；同時利用殺鮭氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、維氏氣單胞菌其他3種單胞菌作為模板檢測LAMP引物的特異性。同時，設置以ddH2O為模板的陰性對照。

2.5 LAMP反應的靈敏性分析 利用外引物F3和B3，擴增嗜水氣單胞菌的Pilin基因。擴增產物進行純化回收后，用ND2000超微量核酸分析儀測其DNA濃度。然后對擴增產物進行10倍倍比稀釋，均勻稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10。 分 別 用 10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2濃度的 DNA 為模板，并設置ddH2O為陰性對照。進行LAMP靈敏性試驗。

3 結果與討論

3.1 LAMP方法的特異性 利用嗜水氣單胞菌的Pilin基因設計的LAMP引物進行特異性分析。Pilin引物能夠特異性擴增嗜水氣單胞菌的靶基因見圖1。陰性對照均沒有出現非特異性擴增，表明引物特異性良好。

圖1 嗜水氣單胞菌（Ah-1）LAMP方法的特異性

結果顯示：嗜水氣單胞菌株反應結果為陽性（+），肉眼觀察反應物呈黃色。殺鮭氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、維氏氣單胞菌等3株其他對照菌株反應為陰性（－），反應物呈橙色（染料本身的顏色）；ddH2O對照亦是陰性（－）。說明嗜水氣單胞菌LAMP方法的特異性良好。

3.2 LAMP方法的靈敏性 利用ND2000核酸分析儀檢測Pilin的原始DNA濃度。對DNA進行10倍倍比稀釋以后，分別用 10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2濃度的DNA為模板，進行LAMP反應，然后檢測結果見圖2。

圖2 嗜水氣單胞菌（Ah-1）LAMP方法的靈敏性

結果顯示，在63.5 ℃的恒溫條件下，嗜水氣單胞菌最小檢出濃度是10-6ng/μL。

3.3 討論 嗜水氣單胞菌是細鱗魚馴養繁育中的高發致病菌，一旦發病，難以根治，經常會導致重大的經濟損失。在細鱗魚的人工馴養中，迫切需要一種快捷、簡便的方法對病源菌進行準確、快速的診斷，用于疫病的早期預防和治療。

本研究將LAMP技術運用到嗜水氣單胞菌的快速檢測中來。篩選嗜水氣單胞菌的Pilin基因設計特異性LAMP引物，在63.5 ℃的恒溫條件下，嗜水氣單胞菌的最小檢出濃度分別為是10-6ng/μL。結果發現，該方法特異性好，靈敏度高，可將病源的檢測時間控制在1 d以內。該方法所需儀器簡單，1臺水浴鍋或恒溫箱就能完成反應。結果通過肉眼觀察反應沉淀的顏色即可進行判定，特別適合基層疫病的快速診斷，具有非常實用的應用價值。